超薄切片样品制备技术.docx

=12.25/V1Z2即入8I/V加速电压V越大.波长越短,仪潺的分辨本额越高第二节超薄切片样品制备技术超薄切片技术是透射电镜总肥本的生物样品冽备技术；切片的厚度小于0.1n分类：普通超薄切片冷冻超薄切片一、取材1.取材的原则准确迅速防根伤低温体枳小2、取材的方法（I）动物材料：边固定边取样（2植物材料；先取样、后固定（3）体外培养细恂及其它单体材*1离心法；琼脂预包埋法；琼脂铸股法（4）骨组织的取材取材预固定漂洗脱钙后固定二、固定（FiXatiOn）1.固定的概念：用物理或化学的方法快速杀死细咆的过程。2 .固定的潦理：通过固定剂的作用使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联，阻止细胞自溶.稔定细胞化学成份和超微结构。3 .固定的方法根据固定液的成份分为但固定双固定多固定2）常用固定液特戊：1戊二群固定液：优点：海透力强,渗透速度快：能良好地保存糠元、核酸、核蛋白、细胞基质：较好保存抗原，适合于细胞化学的研究：可长期保存样M：使用条件较宽容，适用范围广：用缓冲液配制成2%3%的戊：醛固定液。缺点：不能保存肪肪，对腴的固定效果差；无电子染色作用：对姬冲液的要求较而.2）四飙化彼：俗称抗酸.优点：对脂类、蛋臼城和储脂蛋白的固定较好：增加样品的反空，缺点:港透速率较腔类慢，所以常用于后固定：不固定枪原和核酸：其水溶液在室温下易挥发，有曲性：使用浓度为1%水溶液；固定时间不易过长，否则易使样品变脆。3）高铳酸钾：对僚蛋白的固定较好,如神经的鞘、叶绿体和各种膜结构.3%工作浓度,41C固定2小时.5,常用固定方法:戊:醛钺酸双Hi固定法6.常用镀冲液缓冲液的作用：用来配制固定液，防止样品变形两次过程之间需要用媛冲液漂洗（1）璘酸刖援冲液（2）巴比妥M酸等海缓冲液（3）二甲碑酸盐缓冲液三、脱水：用脱水剂置换样M中的水份的过程1.目的（D含水的样品在真空中蒸发时，一方面降低了电镜的比空度，另一方面，样品是水份蒸发时易变形.（2）利于包埋剂的渗透2,常用脱水剂（1）选择（2）常用脱水剂：乙酹或丙阳3、方法：浓度梯度逐级置换的方法,每徼大约15分伸四、包埋；包括浸透、包埋和聚合三步。1.方法1浸透目的：用包理剂逐步替代样品中的脱水剂,使包埋剂M充样品结构中的空间.硬化后可支撑样品保持其原有形态.2）包埋目的：电镀的样品块的Imm见方,体积太小不便于夹持切片，将其包要于较大物体中，形成一整体便于切片悚作,模具：常用药用股囊、包埋模板3聚合目的：软的包理剂经加温次合后成为硬的包埋块2,常用包埋剂：包埋剂：是包埋剂的主要成份，hEPON812（环氧树脂812交联刑：结构交联.使化、固化：DDSA:十二烷基琥珀酸叶软性：MNA：甲基内次甲基二甲酸酊,硬性：催化剂：加速剂，不参与交联反应：常用如：DMP-30：二甲氨璃卬超苯酚：增果剂：增加切性，避免包埋块过腌，常用如：DBP.临紫：卬酸;丁酯五、切片修块制刀制膜切片扮片六、染色I、电子染色的黑埋：生物样品主要由C、H、O、N等轻元素构成,对电子的散射能力弱，即电子反差小，需羟柬佥属盐溶液染色后增强样品与背景的反差才能观察，常分为正染色和负染色.2,正染色的原理：用重金M盐溶液作为电子染色剂处理样品.样品中不同成分或结构与电子染色剂结合或吸附麻不同,结合量较大昔形成暗区，反之为亮区，即增加了样品反差，,般适用于整体组织结构的染色观察，3、电子染色剂：各林童金属盐，如：抽'铅、钺、钻、铁、流、钱等重金属盐类。一'负染色技术：制备样品悬液一吸附样品负染色观察二、负染色正染色：一般所谓染色是用染色剂增强所要观察的结构的电子密度（呈撰色）,而背景不被染色（呈白色）,又称为IE染色,适用于整体的如织结构的观察。负染色：与正染色相反,对结构本身不染色呈白色.对结构的背景染色（呈黑色,可衬托H1.样M结构；对生物大分子、细菌、区生动物、亚细胞碎片、分离的细胞涔、蛋臼晶体、病毒簪单独、分岗的样品，比正染色效果好。负染色样品的特点：染色前将样品制成悬浮液：具有一定纯度和浓度，必要时分离、提纯、浓缩.第四节冷冰制样技术一、冷冻制样的原理和特点2,特点优点：步骤少、时间短,快速：避免化学处理引起变形及试剂残留：保持细胞组织更接近生命状态.缺点：仪器用贵专用，成本高：技术难度大，成功率低.二、冷冻技术的关键I、冷冻失败的原因一冰品的形成冷流速率慢：冷冻速度愈慢，冰晶颗粒愈大样品块过大三、冷冻保护】、原理样品中游离态水与冷冻保护剂结合，使细电液浓度提而，冷冻点降低，减轻冰晶的形成.五、冷冻制样技术1 .冷冻干燥技术：好样或经催固定的样品一一冷冰保护一一快速冷冻固定一一低温、真空一一水分直接升华、干馔2 .冷冻脱水技术：新鲜样品一一冷冻保护一一快速冷冻一一逐步用有机溶剂置换、脱水一一包埋、切片、染色、观察3 .冷冻超薄切片技术：新鲜样M预固定一一冷冻保护一一快速冷冻一一冷冻超薄切片二、免疫电镀技术概述免疫电镜技术免疫学与电镜技术的结合,用口标记电子致密物的抗体作为示踪物，利用其与抗原特异结合成抗原-抗体结合物的特性,在电悔下根踪、显示、观察抗原2.核酸样品提取的关犍：注意保持长链结构的完整性：除去核酸溶液中的蛋白：足幡的浓度;新鲜制备第一节SEM原理一、SEM成像原理1.成像信号：二次电子（ES）：主要成像信号背做射电子（EB）:次要成像佶号2.决定ES产M的因素ES产率（ES发射系数”=IES/Iq（1）加速电压:在一定范围内.V增大时8也在增加(2)元素的原子序数Z:S陆Z的增加而增加(3)入射角O:在一定范围内，随O的增加而增加，邮与样品衣面的形态结构有关.3.ES成像反不：实验条件确定时,V对ES的影响就确定了;对样品表面迸行唉腹处理,Z对ES的影响就隔定了；BS的数量只和样品衣面的结构有关.因样品表面形貌结构的差异,各处被激发出的和被检测器检测到的二次电子数盘不同：信号强弱不同：形成与样品表面凸凹形貌相应的明暗图象,即二次电子图软.二、SEM工作原理I.扫描电子束对样品的表面进行光械状扫描：行扫描.在一行上逐点扫描；帧扫描，扫完一行后，光束下移.再打另一行，直至全幅.3.SEM的同步扫描和亮位的控制：同步旧描的实现：同一信号发生器控制：每一象素点亮度的控制：次电子信号检测器的输出信号控制荧屏上相应象素点的亮度；扫描电镀的放火倍数=ab：扫描电陵的图像分辨率由电子束班克径决定电境中电子束在样品表面的扫描幅度b显象管荧屏扫描幅度a第二节SEM的结构电子光学系统：电子枪：案光镜物镜；样晶空扫描系统：行扫描战圈：帕扫描我圈；扫描信号发生器检测系统二次电子检测那显示系统：显象管文空系统：机械京；如故泵：供电系统一、电子光学系统1 .电子枪：结构向TEM的电子枪,但加速电压较低30KV。2 .聚光镜:把来自电子能的电子束(50Um)会聚为IOnm左右的电子探针(e1.ectronprobe).物镜:实际上是一个聚光镜.起到会聚电子束的作用,而不是放大成像.因为萦贴样品上方,故称其为物镜.3.样M宓二、扫描系统1.行扫描线版和帧扫描战圈:由两处电描线圈构成.作用是控制电子束在X、Y两个方向上有规律的偏转.愤筒、观察用显像普.据影用显像管3 .扫描信号发生器:产生锯齿波,同时控制三处的扫描线圉，使电子探针在样品上的扫描和显像管电子束在荧光屏上的移动同步、同序。三、检泅系统,二次电子检测器：收集极、闪烁体、光导管、光电倍增管第六堂SEM的样品制备常规制样程序：取材一清洗一固定一脱水一干像一粘样一饿腹一、取材：准、快、轻、小,低温：、清洗：目的：减小任何两步操作之间化学试剂的干扰清洗样品表面的泥污、粘液方法：液体清洗：双蒸水、眼冲液、醉液超声波清洗：控制超声波频率和时间三、固定：用物理和化学的方法快速杀死细胞的过程.方法：化学法：戊二羟饿酸双固定法物理法：冷冻固定法四、脱水目的：除去样品中的水份方法：乙解或丙酬浓度悌度置换法30%50%-70%-80%-90%-100%*3五、干煤目的：除去样品中易蒸发的脱水剂方法：自然干燥法冷冻干燥法临界点干燥法六、祐样目的：防止样品观察过程中样品掉落导电处理方法：导电胶、双面胶七、镀膜目的：样品更易产生二次电子防止样品内部的信息干扰传导电子，防止样品表面放电样品更能耐电子束的打击方法：围子溅射法直空喷镀法第三节临界点干燥技术(一)临界状态和临界点密闭容器中的液体：加热一液体蒸发一气体密度加大一直至气液密度相等一气液界面消失一临界状态一达临界状态的最低温度、压强点一临界点.（二）临界状态度特点：气-液界面消失，整体密度一致：分子密度大一接近于液体：分子运动速度快一接近于气体：（六）临界点干燥实验步骤（I）/换（2）临界点干燥仪准备（3）准备样品（4）注入液体二氧化碳（5词温（6）排气（7）取出样品第四节金属搬膜金M镀度将样品用导电胶粘在样品台上，在样M衣面该上层薄而均匀的金网股（20nmP/的金既不影响样品本身的结构形态，又使之具壮电性。提高图像的质V,金属镀膜的方法：离干溅射法和口空喷镀法.一、肉子激射镀膜法（一）离子溅射该媵法原理低出空下（有少许空气）一阴阳极间加蒲压放电一空气电穗一阴、阳离子一阳离子飞向阴极一打击阴极表面一阴极金属原子或离子激射出来一落在样品表面一镀膜,（二）肉子激射镀膜法的操作A.准备样品：样品充分干燥.B.放置样品；样品放在把电极的正下方，赢好真空溟C.抽真空：D.加Bf压:定时2分钟一打开高压开关一调节放电电压,电范应达5mA以上.E.该膜：膜厚度的IOnm.略呈金黄色.二、真空喷镀镀膜法1 .工作原理:真空一高淑加热金属丝一金属蒸发一样品置于距金属丝5cm左右处一蒸发的金属原子喷落在样品表面一次流一层金原膜-朕极薄,精确熨形特征X射战的产生：裔的电子束（电子探针袋击样品原子一打出其若干内层电子，产生空穴一该电子的外层电子即降低能绘来填补空穴一放出多余的能电一X射战一不同元素产生不同波长的X射线一特征X射线一元素分析.连续X射税的产生：入射电子在原子核电场力作用下发生不完全弹性散射一人射电f改变方向并不同程度的损失部分能-该能量可为零至人射电子最初的最大能做之间的任意做一产生连续波长X射我一连续X射线为人射电子宜接产生一不带有样品信息一背景喉音.1,波谱仪（WDS）:X射税波长一元素分析：* 样品的特征X射以6角投射到晶格间距为d的分光晶体上，仅当满足下列关系时，检测器方可收到信号：=2dsin«.据d及。可计算出波长A,进行元素分析。* 连续改变。角，可作波长扫描；* 某一d值确定的晶体仅可测属一定波长范围，需改有不同d值不同的几块晶体* 优点：分辨率高：定收分析精度高；元素范困广:BZU92;* 缺点：不使于元泰普查，需更换分光晶体.稳定性差,体枳大：2 .能谱法<EDS>测量X射线能.破，由=t+cE=1.2.396E-XZ-元素分析，样品X射规一SM1.i）检测涔一电子空穴对电脉冲SEX-一元素优点：快速元索普克：灵敏度高；无移动部件.稳定性好；缺点：需液象冷却；分辨率低：轻儿去校刈困难（Na1.I-U92）:背景砒激光扫描共聚焦微债1.SCM优势：避免多层图像电登、提高分辨率可分取不同层面图像,多层次观察多层次图像可用计算机合成为三维图像,作立体观察(二)1.SCM的结构I、激光光源2、光学显微镜系统(I)荧光显微镜(F1.UOreScenCemicroscope)样品具有自发荧光或