原核诱导表达.docx

原核诱导表达的标准操作程序（SOP；.目的：使本试验室工作人坊了解i先导去达的操作过程，并能实际动手诳展原核诱旧表达-系列试脍.二.适用范围：本SOP适用于对新法因克隆的去达，并针对新舰因产生的可溶性蛋白.三.试验原理：的乳能操纵手含Z、丫及A三个构造基因，分别编码半乳糖伴肺、透油和乙凝基转移前，此外还有一个操纵序列0、一个启动序列P及一个调整班因1。1联因编码种阻遇蛋白，后者与0序列结合，使操板子受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点.小P序列、。序列和CAP结合位点共同构成IaC操纵子的网控区，一:个鼠的编码基因即由同一网控区调整,实现加因产物的协调表达,在没有扎糖存在时，Iac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵卜表达的1.aC阳遏蛋白与O序列结合，阳咫RNA景合酹与P序列结合,抑制转录起动.当有乳糖存在时,Iac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，英正的法导剂并非乳精本身.乳越进入细胞，经b一半乳精背Ife催化，转变为半乳期.后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象改变，导致阳遇蛋白与O序列解离、发生转录.异丙基破代半孔楠昔（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而特别稳定,因此被试5金室广泛应用.四、试剂打算：（一）试验器材的灭曲：枪头的灭菌：Im1.,2001.201.的枪头放入枪头盒.用报纸包住（2层）,放入高压灭菌锅中灭菌，I21C,20min,80C烘箱中烘干，常温放眼。摞口管及肉心管的灭菌：将蝶”管和高心管分别放入铝制饭盒中（盅子要拧松，离心管的管靛翻开），放人高压灭由锅中灭曲，121C,20min.80C烘箱中烘干，常温放置。50m1.高心管的灭菌：将50m1.离心管用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌,I2IC,20min.80C供箱中烘干，常温放置.（二）1.B培育基的配制液体1.B培H票（I1.）：Ifi白珠IOg氯化钠IOg酵母提取物5g调PH（ft到.高乐灭菌.4C保存.固体1.BJSW¼（I1.J：蛋白珠IOg氯化钠IOg酵母提取物5g琼脂粉15g高压灭前，不烫手的状况下参与抗性，抗性：培育型=1；100O（也节，卡那通常浓度），混匀。立刻在无曲操作台中倒平板，并开大风吹干。用封口腴封住,倒置放于4X2保存。（）IM1.PTG的配制:经过计算，IOgIpTG可以配42m1.的IM1.PTG,买来的粉末状的IPTG一般全部配成IMIPTG.I、无菌操作台紫外线照镶后通风.2、用少崎去离子水将IPTG溶解完全，并定容。3、在无曲操作台中，用2m的速器将配好的IPTG沌入灭曲后的离心管中，过泄除菌,-20C保存.考前须知：在用谑器珞IPTG注入离心管时，先用针头吸IPTG,然后将枪头拔掉,排出气体，沌头参与IPTG液，花使针管与沌器相连，保证整个装置无气体进入.沌的过程中.手不他碰漉头.(四)3SDSMGE1.oadingbuffer的配制：3×SDS-I½GE1.oadingbufferIOmIIMTris-Hc1.(PH6.8)SDSBPB（洌酚收）30mg甘油（丙三丁）3m1.去商子水1 .将除BPB以外的药品完全溶解.SDS常温下很难溶解,可以在37C水溶溶解.完全溶解后，再参与BPB进展溶解，2 .把溶好的buffer分装到的离心管中，InW管，常温放汽，3 .运用前，W参与301.装将乙卷.考前须知：软基乙酹为危急品.参与的过程在通风枷中完成,弁且带好手套，（）IOXPBS的配制：PBS(IOxPBS)I1.NaH2PO4JH2ONac1.85gNa2HPOi.12H>O用去肉子水将以上药品进展溶解。（溶解的特别慢，可能须要过夜）周PH值到,用的灌膜过液.常讯保存.工作时用的是IxPBS.(六)Tris-Hc1.(PH8.8)的配制：Tris-Hc1.250m1.Trisg1 .用20OmI去禺子水将TriS溶解。2 .用浓盐酸冏PH值到.3 .调好PH的Tris-Hc1.定存到250m1.4 .的沙膜过谑，常温保存。考前须知：TriS的缓冲实力彼强,调PH值时,费些时间,但不要调过.3.调好PH的TriS-HC1.定容到250m1.4.的渔膜过谑，常温保存“（八）30%丙烯酰胺的配制:30%丙烯眦胺250m1.丙烯酰胺72.5m1.BIS卬叉丙烷配胺2.5m1.1.把药品用去黑子水溶解后定容到250m1.2.用泌纸过逑，放在棕色粒子中，4C保存.考前须知：两种药品有以性，配制过程要带手套和口罩。5 九）10%SDS的用制：1 .IgSDS参与IOmI去离子水进展溶解2 .分装到离心管中，-2OC保存。（十）10%过硫酸僮的配制：1 .Ig过破酸皱参与Iom1.去离子水进展溶解，2 .分装到离心管中，-20C保存。（十-）5xSDS-PAGE电泳缓冲液的配制:5×SDS-PGE电泳谖冲液I1.TrisGIyCinC:甘刎酸）94gSDS5g将以上药品用去高子水溶解后定容到I1.-常涉保存.工作时用的是IXSDS-PAGE电泳缓冲液。（十二）考/斯亮蓝R-25O染色液的配制：考乌斯亮蓝R-25O染色液I1.1 .往Ig考马斯克i½R25O中参与25Om1.异丙醉，在破力搅拌器上搅拌六小时以上，2 .参与65OmI去离子水，破力搅扑器挽扑过夜，3 .再参与100m1.冰型酸进展溶解.极力挽抨器搅摔.4 .在通风橱内用谑纸进展过酒.常温保存.柒色液只能反究用两次“考前须知：在疏力搅拌器上搅拌时,要把容器封口。（十:）脱色液的配制:脱色液I1.除酸（冰乙酸）100mI乙醉（无水乙肿）50m1.去卷子水850m1.常温保存.四.试验步骤：（一）：质粒的转化I,运用无储操作台之前先用75%的酒精擦拭，然后将灭曲的培H柜以及全部要用到的器具放到超净台上，在开紫外照楸30min左右.操作之前，关掉紫外，翻开通风树，将手用酒精擦拭后开场操作.2 .从-8（FC的冰箱中取出表达菌（B1.21）的感受态细胞（每管1001.）,ft-80冰水中溶化.3,载体（PET32a等）与基因片段的连接后期粒1.1.媛慢的参与到1001.B1.21感受态中.冰置15min.（无菌操作）3 .42C下热激90s,的后在冰水中冰置5min.4 .涂板：先将涂布棒用酒精棉球擦，然后用酒精灯火焰烧，放汽等它凉却.把处理后的感受态点在含有抗性的固体培育葩（定带或卡那等）上。用冷却的涂布棒进展涂布,左手把该盖拿起,小指轻轻也动培讦基，右手来涂，涂到培育基外表快干。（无菌操作）5 .放在37C培育箱中，例置培育过夜。考前须知:1 .质粒的转化时.防粒是冻在-20C的冰箱中,等它完全化了在进展吸取.往好受态中参与项粒时，肯定要缓慢,因为感受态特别脆弱，防止通受态受伤.2 .质粒的转化时，热激的时间90s,肯定要限制好时间。3,质粒的转化时，涂布棒在涂布附，泞定要晾凉涂布棒”防止呼受态被烫死，或冏体培存基的损坏.（二）：挑薄与接曲：1 .无菌操作台紫外线照辘.后通风.符转化后的平板取出.2 .在无菌操作台中,把消毒后的螺口管（一般一个基因取四个螺n管,展平行试验）取出，在酒精灯的外焰上灼烧螺11管管口。3 .火苗格的1.B培育基从冰箱中取出，在酒精灯的外馅上烧一下培育翦瓶口.吸取1.B培育基（Tftm1.）参与摞11管中.后参与抗性（氨不客素、卡那等）.显苇霉索（卡那）：1.B培百基=1.1.（XK）（1.）,抗性由教体确定.4 .镣子用酒精槌球擦拭，并在酒精灯的外焰上灼烧，将镣子脱凉，用脱冻的铅子，夹取2O1.小枪头，在转化后的平板上挑取单曲落,扰到培育基中.5 .接好菌的端口管.进展摇菌.37C.180rpm,摇到菌的对数期（0。,帆低），时间也许2-3h可以模相看到手即可.（留意不要摇过）6 .用完的平板用时口服时住，倒置放于4C保存。7 .假设干脆用曲液进展接茵，接阳比例为，阳液：1.B培育域=1：100,考前须知：1 .接倒吸培H脸时，把放芭培闩基的三角就倾斜才吸取培白班，移液枪屋眼不要插进三角械中.2 .接函时肯定要参与抗性.挑曲落时.要挑单个的菌落.且不要把培育基也扣起来.3 .摇带不要过了它的对数期，2小时后随时留意其生长状态。（=）小量保菌：1 .无菌操作台紫外线照耀.后通风.2 .将擢到标准OD值的储液进展小演保的，先在酒精灯的外焰上灼烧蝶口管管口.3 .保萧：从灭菌的饭盒中取出4个的灭菌的离心管，参与501.的灭曲后的80%的甘油,并分别参与相应的350P1.菌液.一个基因的四个平行试验菌都要进展保苗.（假设不保苗,试验不能进展更复，只能从头做）4 .标消保郎的类别,名称，时间,如“B1.21PET32aVAV1号20211其中的1号是平行比照中它排几号.5 .混匀.-20C保存.考前须知：1 .在小境保阳中，一个基因的四个平行比照都要保储，否那么得重新换条件。2 .在小量保菌中.菌液与甘油肯定要混匀在保存,有那么菌会被冻死.（四）IS白诱导衣达条件摸索1 .无菌操作台紫2 .小盘保窗后的下进展i秀呼（如下列图外线照耀，后通风.四个平行试验组，分别参与不同终浓度的IPTG在不同的诏度条件）：比照编号IPTG终浓度疏导温度诱导温度1号1mmo!1.3h37C2号mmo1./1.3h37-C3号Immo1./1.3h30C4号m111.1.3h30,C（£）小量收曲1.将诱导完成的四个平行试脸组菌液,分别取HZm1.对应装于4个不同的离心管中并做好标记。剩余的平行试蛤祖带液放入4C保存。2.离心7000rpm.2min.使储沉淀.3.把上层培育基倒掉,用Im1.IXPBS把表达曲重昼，再次离心700OrPm,2min,使曲沉淀.4.把上层IXPBS倒掉，再次离心同步嶷3.5.用801.IxPBS把表达斯体重悬，6.在四个平行的垂悬液中，分别参与801.3×SDS-PAGE1.oadingbuffer,（把3×SDS-PAGE1.oadingbuffer当成2xSDS-PAGE1.oadingbuffer用）7.煮样8min.（糊开锅之煮）8.离心1300OrPm,IOmin,吸上消.9.迸展SDS-PAGE电冰。考前须知：在点样时要胡开锅孟煮，防止小样进水，解设样进水，那么不能再用.（六）SDS-PAGE胶的配制1 .别肉股的配制（I）找出配套的胶板,用擦镜纸擦干冷，井也1定在配股器上,后用去离子水试漏.（2）假设胶板不漏水，就进展别离收的配制,依次将水、30%丙烯酰胺、Tris-Hc1.（）、10%SDS.10%过破酸侬加到干净的小烧杯中（如下列图）,混勾。（Imm的胶板，一般限一块股用5m1.所配的胶浓度一般为12%,但浓度也要视状况而定.蛋白越小，股的浓度越大.）SDS-PAGE分离胶配方表0、GH3O30%Ayi11¼3!.5MTHC<c*<1.10S0Sg七班MTBMeDroHQ30A><am1.5MTn*0(oK8SSDSTEME