喜树内生菌的分离和鉴定.docx
喜树内生菌的分离和鉴定摘要在本次研究中，共从喜树中分离出161个内生真菌，根据形态和分子分析分为16个种。这些真菌由2种常见的属和14种不同的属组成。这表明在喜树中内生菌是非常丰富的和多变的。使用滤纸扩散方法筛选抗病活性的菌落表明在测试的菌中46.7%至少对一种微生物具有抗菌活性。通过T1.C和液相-质谱、质谱连用筛选能产生喜树碱类似物的内生菌衍生物证明一种X能产生9-MCPT（9-甲氧基喜树碱）当菌株在沙氏液体培养基上，在摇瓶和实验室规模的发酵条件卜.培养12天。这项实验表明喜树的内生菌沙氏液体培养基：用于真菌的增菌培养，还用于一次性使用卫生用品真菌定性检测配方（每升）：蛋白豚Iog,葡萄糖40g,氯霉素0.1g最终PH5.6+0.2关键词：内生真菌9-甲基喜树碱葡萄溃疡病病菌天然化合物介绍：内生真菌是部分或全部生活史在无症状的植物组织内部的微生物。内生菌在植物中非常普遍。越来越多的证据表明内生菌的种类是丰富的多种多样的。他们在给宿主提供益处上扮演着重要的角色。更重要的是内生菌能产生大量的植物衍生的和新颖的生物活性化合物。一些还能产生新的抗菌和抗癌物质，尽管内生菌创造了巨大的生物和化学的多样性，但是仅仅很少量的植物相关的微生物被研究。内生菌的群落会被很多因素影响，例如地理位置，气候模式，生理和co1.onized组织的特殊性。因此为了适应不同的环境条件，不同的真菌形成了特异的内生群体和组织类型。除了地理区域和植物组织对内生菌的群落产生影响，分离策略（媒介的营养成分）经常偏爱于真菌的群落，这种偏爱也会无意识地导致对内生菌组合的偏见。因此，用优化的分离策略从特殊植物中分离内生菌或许会提供新的寄回去发现丰富的种群和天然产物在医药、农业和工业的开发上在秦巴山区，坐落在暖温带和北亚热带交汇带，这里有药用植物的原始森林，例如喜树和南方红豆杉，以前的研究表明一些内生菌如会产生CPT类似物，然而在特定地区的喜树含有丰富的内生真菌和新颖的未知的能产生CPT的真菌，此外，在这个地区从喜树中分离的内生菌将提供一个有前途的有生物活性的真菌代谢产物。在本论文中，我们报道了内生菌群落和喜树的关联，这些真菌被筛选产生CPT类似物的能力和抑制被测试微生物的生长。材料和方法植物材料和表明消毒采集生长在中国秦巴山区的喜树的健康茎，用流水冲洗1个小时,把茎完全浸泡在70%的乙耨中1分钟，在0.1%升汞8分钟，用无菌水漂洗6次。最后取漂洗的上清液转移到PDA培养基上，在28摄氏度的条件卜.培养7天,确定附生真菌从内生真菌中排除。植物组织表面消毒被用来分离内生真菌。分离内生真菌样品被放在选择分离媒介上(补充100mg/1.的链霉素)（八）PDA,(b)PDA添加0.5%的麦芽提取物,(C)PDA添加0.5%的椰子提取物。样品在28C条件下培养2-15天获得纯的内生菌株内生菌的形态内生菌在28C条件下我PDA培养基上培养7-14天获得菌落。微观形态特征如大小和分生池子的形状，菌丝分隔和染色作为经典的鉴定方法来确定真菌内生真菌的分子系统学研究内生真菌的DNA用CTAB方法提取。ITS基因片段通过基因的前体ITS1.和ITS4被扩增，PCR反应混合物包括100ng基因组DNA,PCR反应缓冲液，Mge1.2.正向和反向引物，脱氧核甘酸三磷酸、耐热DNA聚合酶，添加无菌PCR水到反应混合物至最终体积，PCR反应过程是：在94C条件下预加热5min,94C条件下1分35转，55摄氏度40秒，721分钟，最后在72条件下扩增10分钟。PCR产物是纯化和有序的内生菌的ITS序列在NCBI中是比较时可用的数据，多序列比对是用C1.UStaIX软件进行的，与空白数据对比作为丢失的数据。一个系统进化树是由邻接法和kimura的双参数距离的计算在3.1大型软件版本下构建的。节点树由1000引导复制支持。无细胞提取物的制备内生菌被培养在500亳升锥形瓶中在16OrPm,28C12天，每个锥形瓶包含300亳升沙氏培养基（10蛋白陈，40葡萄糖），在真空中真菌培养物用棉布过滤，收集菌丝体，冷冻，并在研钵中粉碎。接地菌丝体和发酵液在室温下用甲醇/氯仿（1:4）进行超声波辅助萃取3次持续5小时。有机溶剂用旋转蒸发仪在减压条件卜除去，产生的残留物溶解在25亳升的甲醇里T1.C筛选能产生9-MCPT菌株残留的有机物通过T1.C分析测定：硅胶预涂板，配制的溶剂（氯彷：甲醇=9:1）少量的9-MCPT用分别用254和365紫外光检测1.C-MS/MS检测真菌的9-MCPT光谱分析是使用电喷雾电离，气体雾化是在2u1.min,毛细管电压为3.0Kv0分离时通过使用C18柱的高效液相色谱，水（0.05%甲酸+5mM醋酸筱）/甲醇（3:7）作为流动项释m1./min抗菌活性测定微生物的测定包括被接种在1.B琼脂培养基（细菌）和PDA培养基（植物致病真菌），28C在沙氏培养基上生长7天的内生真菌的新鲜发酵液直接加到无菌滤纸盘上。之后滤纸放在1.B琼脂平板上和一个固定量的指示菌开始新的传播，放在PDA培养基距致病菌大约2-3厘米，沙氏培养基被用来做抗细菌测定的阴性对照：增加有效雁素作为抗真菌的阳性对照。每个实验重复3次。所有的植株在28摄氏度条件下培养2-7天，用于测试物种抑制区的测定。结果培养内生菌的分离，分析表面消毒的树皮放在3个不同的培养基上
