无性真菌烟草尾孢质粒标记尾孢菌素缺失突变.docx

无性真菌烟草尾泡质粒标记尾他菌素玦失突变体摘要；我们已经成功改编质粒插入和限制酹介导转化产生尾泡前布素缺失突变体,缺失突变体是从无性植物致病真菌CerCoSporanicotianae.烟草尾抱得到的.转化程序上先1«线性化切粒或者限制性内切陶的使用显著降低了转化频率,但是促进了一个复杂的不明确的质标集合方式,这导效C.nic。Iianae基因俎的突变“载体DMA通常整合到多拷贝上，当醉添加到转化混合物上时没有观察到单拷贝插入的增加，出干1873年科化子试验，恢奴了39个推定的尾抱曲毒素（CIb）突变体,这显示J尾泡雨素产牛的水平。7个Ctb突变体用预先城性质粒不加的恢发.这些被认为是无-RE亚突变体.特升性插入和突变体衣里的相关性被确定，ft定方法是用野生的株救援I®粒作为娓因破除软体.十五个当中的六个救援质粒检测产生尾他的素块失转化株,当正新加入到野生葡株时.结果显示在插入位点和昆艳菌家缺失表型中忏联系,一段片段侧面攻击插入位点.这个插入位京从个植入突变体上恢现的.这个片段的序列分析显示它是在行在'其他典荫的聚制合酪的酰基转化府城而度同源的序列上敲除的.这种聚加含防施因的饿坏使用救援鲂粒.导效突变体在足抱苗素产生上有缺陷。因比，我们第一次提供了分子证据，证明了足胞的素合成是通过聚阳化合物途径.前吉讨论这个工作中，我们已羟证明了使用旗粒标记突变体形成的方法产生C.nicotianae突变体是可行的,这种突变体能修改变产生甩布苗案的施力通过质粒插入和限制性内切醒介导转化法形成的突变体能的产生?很插入他电在生.物体的付性阶段,将非突变体南株回接一个假定的标记突变体通常被用来确定哪一个插入位点是可以改变我现型的功能的.在生物体中.例（InCnicotianae,它然乏有性阶段，这个方法显然是行不通的。用救援瓶粒直接破林如其他立的系统描述的那样，提供了一个可供送挣的方法，使质粒插入位点和可改变的表现里有关联,然而，这种方法没右被广泛（史用或许是由于相应佻合体的低城率.正如我f1.也在C.nicotianae上观察到的.C.niS1.ianae上野生型基因的破坏通常造成低翔率破坏.这个显示门司源整合对C.nicotianac是无利的小件,这个事件的罕见解铎了为什么我力仅仅获得了低频率尾的前案产生突变体.是从6个救援质粒获褥的，尽管我们转换15个救援质粒进入到野生空中.许多其他函中,带外线性质粒和限制性内切版的转座子能提高转化嫉率,作为对比，在这个实验中以福的转化频率是通过C.nic。Iianae上带有环形，未羟处理的短粒DXA转化而来的这个实验中质粒DNA有任何一种醉的战性化降低了，专柜子恢U的数信。如果额外的储在转化期间加入，转化率则降低的更多，降低与懒的增加成比例。这个发现表明，限制性内切附对C.niceianac琮生质的生存能力或者是再生能力有有害作用.这个现象在其他衣;画中也被观察到了我们的制果与其他关于质粒的类型和构造、限M性内切陆的类型和散状、对Rnn标记影响的精确转化方式的实验相似。在REMI中，限制性内切能绑定在线性化陶粒DNA的末端，促进祭台到基因姐质校中.通过非同源的末然连接机制.然而，在我们的实验中，大部分的转化株包含多款载体史制,不考虑牯化混合中载体结构或并薛的存在.这个结果与其他制形成对比，其他的限制性内切酸的添加增加了单把贝整合时件的数砥,SOUthern杂交显示，至少我体的一个拷贝与直苗的基因组相结合，这种结合通过兼容的结束来创造,创造通过各自的版。测序质粒PCtbI救援HM击1.>A片段PCtb1.救援从突变体Ctb-I.ctb-1尾胞菌素产生中完全缺乏.这个质粒被限制性内切醐消化,存在于PbarkS1克隆位点，段0.8kh的XhoI片段测序.这个序列变彼流分带有与聚丽介前高同海的蛋白，预测的239个诋制酸用这个序列说明，C.n1.8tia»1B分聚三因（命名为CTBD,在区*±：“）35%同性和505ZMU似性需要度基转移他活性,在其他真厢聚例合册上.有趣的是,用救援片段编刊的瓶基转移酹区域IjTOXI编码的PKS没行相似性.数据显示C.nicOtianHC期因组包含一个CTBj单一拷贝.