生物化学分子杂交.ppt

分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & Blotting Technology核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，单链分子放在同一溶液中，或把或把DNA与与RNA放在一起，只放在一起，只要在要在DNA或或RNA的单链分子之的单链分子之间有一定的间有一定的碱基配对碱基配对关系，就可关系，就可以在不同的分子之间形成以在不同的分子之间形成杂化双杂化双链链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理（一）印迹技术（一）印迹技术 应用：应用：核酸靶核酸靶DNA或或RNA序列的定性与定量分析。序列的定性与定量分析。（二）探针技术（二）探针技术 探针探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的标标记其末端或全链的已知序列已知序列的多聚核的多聚核苷酸，与固定在膜上的核苷酸结合，判断苷酸，与固定在膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。是否有同源的核酸分子存在。 探针的种类： 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 人工合成的寡核苷酸探针53外切酶活性二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体、重组质粒和噬菌体的分析。的分析。（二）（二）RNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting) 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 Paper TowelsSouthern BlottissueSDSProtKPhenolChloroformethanol precipitationSpinAgarose Gel Electrophoresis_+3限制性内切酶谱分析法限制性内切酶谱分析法 限制性内切酶限制性内切酶 特异性特异性DNADNA探针探针 待测序列中发生突变时会导致某些限制待测序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶酶切位点发生改变，导致酶谱的改性内切酶酶切位点发生改变，导致酶谱的改变（如特异性片段的大小和多少改变），使变（如特异性片段的大小和多少改变），使得电泳迁移率改变得电泳迁移率改变Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)5 3 正常基因正常基因5 3 突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析RLFPRLFP分析法分析法中性突变：中性突变：人基因组中，平均每人基因组中，平均每200200对碱基可发生一次对碱基可发生一次突变，这种突变对生物体的生存既没有好处，也没有突变，这种突变对生物体的生存既没有好处，也没有害处。害处。DNADNA多态性：多态性：中性突变导致个体间核苷酸序列的差异。中性突变导致个体间核苷酸序列的差异。限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性: :由于多态性发生限制性酶切位由于多态性发生限制性酶切位点上，导致导致酶切可产生长度不同的片段。点上，导致导致酶切可产生长度不同的片段。 RNA印渍技术主要用于检测某一组织或细胞中已知的特印渍技术主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。达情况。Northern Blot放放射射自自显显影影照照片片目目 录录RNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳3kb0.4 kbNt36382604623Northern blot hybridization应用举例应用举例GAPDH0d 2d 4d 6d 8dNorthern blot 杂交分析杂交分析mRNA的表的表达达靶靶 mRNAWestern Blot三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较 其他其他斑点印斑点印迹迹 (dot blotting) 原位杂交原位杂交 (in situ hybridization)DNA点阵点阵 (DNA array) DNA芯片技术芯片技术 (DNA chip)菌菌落落原原位位杂杂交交原位杂交技术可分析基因在染色体上的位置原位杂交技术可分析基因在染色体上的位置 原位杂交（原位杂交（in situ hybridization,ISH）是利用分子杂交技术对）是利用分子杂交技术对基因在染色体上定位的一种技术。基因在染色体上定位的一种技术。 基本程序是基本程序是细胞或组织固定细胞或组织固定预杂交预杂交杂交杂交冲洗冲洗放射自显放射自显影或标记酶显色影或标记酶显色分析结果分析结果。 原位杂交的特点是杂交在显微镜载玻片上中期染色体标本上进原位杂交的特点是杂交在显微镜载玻片上中期染色体标本上进行。行。 荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）是一种非放射性原位杂交方法，用特殊）是一种非放射性原位杂交方法，用特殊荧光素标记核酸（荧光素标记核酸（DNA）探针；）探针； 已有多重原位杂交，分辨率可达已有多重原位杂交，分辨率可达100200kb.分子杂交实验分子杂交实验目目 录录