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第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法1 第三章第三章细胞生物学的研究方法细胞生物学的研究方法第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法2第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞及其组分的分析方法 第三节 细胞培养与细胞工程 第四节细胞及生物大分子的动态变化 第五节模式生物与功能基因组的研究 学习内容学习内容第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法3第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜一、光学显微镜(light microscopy) （一）普通复式光学显微镜（一）普通复式光学显微镜（二）相差显微镜和微分干涉显微镜（二）相差显微镜和微分干涉显微镜（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜（四）激光扫描共焦显微镜（四）激光扫描共焦显微镜（五）其他（五）其他二、电子显微镜二、电子显微镜(Electro microscopy)第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法4（一）普通复式光学显微镜（一）普通复式光学显微镜 1. 1. 构成：构成： 光学放大系统：目镜与物镜光学放大系统：目镜与物镜 照明系统：光源和聚光镜照明系统：光源和聚光镜 机械装置：镜架和样品调节系统机械装置：镜架和样品调节系统 2. 2. 原理：物体经物镜形成倒立实像，经目镜进一步原理：物体经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。放大成像。第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法50.61 分辨率分辨率 DN . sin/2=分辨率分辨率(resolusion)：区分两个质点间的最小距离。：区分两个质点间的最小距离。其中其中: N=: N=标本和物镜之间介质折射标本和物镜之间介质折射率；率； =入射光线波波长；入射光线波波长； =镜口角（样品对物镜镜口镜口角（样品对物镜镜口的张角）的张角） Nsin/2Nsin/2称为物镜的数值孔径称为物镜的数值孔径第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法6 显微镜的几个光学特点：显微镜的几个光学特点：制作光学镜头所用的玻璃折射率为制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.651.781.651.78，所用介，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。质的折射率越接近玻璃的越好。sin /2sin /2的最大值必然小于的最大值必然小于1 1；介质为空气，镜口率一；介质为空气，镜口率一般为般为0.050.950.050.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近近1.51.5。普通光线的波长为普通光线的波长为400700nm400700nm，分辨力数值不会小于，分辨力数值不会小于0.2m0.2m，人眼的分辨力为，人眼的分辨力为0.2mm0.2mm，因此显微镜的最大设，因此显微镜的最大设计倍数为计倍数为1000X1000X。第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法71.1.原理：利用光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅原理：利用光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比。差，表现为明与暗的对比。2.2.两个特殊构件：两个特殊构件：环状光阑（环状光阑（annular diaphragmannular diaphragm）：位于光源与聚光）：位于光源与聚光器之间。器之间。相位板（相位板（annular phaseplateannular phaseplate）：涂有光吸收物质）：涂有光吸收物质和相位推迟物质。和相位推迟物质。3.用途：能观察无色、透明、活细胞中的结构。用途：能观察无色、透明、活细胞中的结构。（二）相差显微镜（二）相差显微镜第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法8决定光学显微镜分辨率的要决定光学显微镜分辨率的要素：物镜的镜口角（素：物镜的镜口角（），），入射光的波长（入射光的波长（ ），介质），介质的折射率（的折射率（N）A A 两束光的相位相同是，干涉两束光的相位相同是，干涉使光的振幅加强使光的振幅加强 ，B B 相位相相位相反是，干涉使光的振幅减弱反是，干涉使光的振幅减弱第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法91.1.原理：利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的原理：利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。明暗效果，能显示结构的三维立体投影。 微分干涉显微镜微分干涉显微镜2.2.应用：应用：适于研究活细胞中较大的细胞器、颗粒及其运动。适于研究活细胞中较大的细胞器、颗粒及其运动。计算机辅助的计算机辅助的DICDIC分辨率比普通光镜提高了一个数分辨率比普通光镜提高了一个数量级。应用这一原理制备的录像增差显微镜量级。应用这一原理制备的录像增差显微镜（video-enhance microscopyvideo-enhance microscopy）可以观察）可以观察微管上颗微管上颗粒的运动粒的运动。第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法101.1.原理：以紫外线为光源照射被检物体，使之发生原理：以紫外线为光源照射被检物体，使之发生荧光，然后在显微镜下观察物体的形态及其所在的荧光，然后在显微镜下观察物体的形态及其所在的位置。位置。2.2.特点：光源不直接照明，而是激发能源；需特殊特点：光源不直接照明，而是激发能源；需特殊的滤色镜；分辨率高。的滤色镜；分辨率高。3.3.用途：在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子用途：在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性、定位。的定性、定位。 既可以观察切片，也可以进行活既可以观察切片，也可以进行活体观察。有免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。体观察。有免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。 第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法11荧光的基本原理及其应用荧光的基本原理及其应用第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法12（四）激光扫描共聚焦显微镜（四）激光扫描共聚焦显微镜 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描, ,形成立体形成立体图像，可重构样品的三维结构。图像，可重构样品的三维结构。 能显示细胞样品的立体结构。能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的分辨力是普通光学显微镜的3 3倍。倍。 用途类似荧光显微镜，但可以排除焦平面以外光的干用途类似荧光显微镜，但可以排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率。扰，增强图像反差和提高分辨率。第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法13 激光扫描共聚焦显微镜的原理激光扫描共聚焦显微镜的原理第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法14倒置显微镜倒置显微镜 荧光共振能量转移技荧光共振能量转移技 (Fluorescence resonance energy (Fluorescence resonance energy transfer, FRET)transfer, FRET) ( (五五) )其他光学显微镜其他光学显微镜荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法15二二 电子显微镜电子显微镜第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法16用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的分辨力是普通光学显微镜的3 3倍。倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。（一）（一） 原理原理第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法17第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法18 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压波长与加速电压( (通常通常50120KV)50120KV)的平方根成反比。的平方根成反比。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等统、电源系统等5 5部分构成。部分构成。 分辨力分辨力0.2nm0.2nm，放大倍数可达百万倍。，放大倍数可达百万倍。 用于观察超微结构即小于用于观察超微结构即小于0.2m0.2m、光学显微镜下无法看清、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构。的结构，又称亚显微结构。电子显微镜的优点电子显微镜的优点第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法19显微显微镜镜分辨分辨本领本领光源光源透镜透镜真空真空成像原理成像原理光镜光镜200nm200nm可见光可见光（400-700nm400-700nm） 玻璃玻璃透镜透镜不要求真空不要求真空利用样品对光的吸收利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色形成明暗反差和颜色变化变化电镜电镜0.1nm0.1nm电子束电子束（0.01-0.9nm0.01-0.9nm）电磁电磁透镜透镜1.33x101.33x10-5-51.33x101.33x10-3-3PaPa利用样品对电子的散利用样品对电子的散射和透射形成明暗反射和透射形成明暗反差差电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法20（二）（二） 主要电镜制样技术主要电镜制样技术1. 1. 超薄切片技术超薄切片技术制作超薄切片流程：制作超薄切片流程： 固定固定 包埋包埋 切片切片 染色染色通常以锇酸和戊二醛固定样品，通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色重金属（铀、铅）盐染色第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法222. 2. 负染色技术负染色技术用重金属盐用重金属盐( (如磷钨酸如磷钨酸) )对铺展在载网对铺展在载网 上的样品染色；上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达可达1.5nm1.5nm左右。左右。第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法233. 3. 冷冻蚀刻技术冷冻蚀刻技术亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜的膜剥下来，此膜即为复膜第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法24第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法254. 4. 电镜三维重构与低温电镜技术电镜三维重构与低温电镜技术 第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法265. 5. 扫描电镜技术扫描电镜技术工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。号。第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法27扫描电镜原理示意图扫描电镜原理示意图第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法28三三 扫面隧道显微镜扫面隧道显微镜第三章第三章 细胞生物学研究方