乳酸含量测定.docx

在TriS-HCl-水合阴缓冲液中(pH = 9.2),利用乳酸在氧化型烟酰胺腺喋吟二核甘酸(NAD) 存在的条件下,由乳酸脱氢酶(L-LDH)催化生成丙酮酸和还原型烟酰胺腺喋吟二核甘酸 (NADH)。，利用NADH是一种强荧光物质,而NAD+则无荧光的性质，通过测定NADH在 340nm处吸光度的变化率，可得出酶促反应速度，并制得标准曲线，样品中的乳酸可由标 准曲线求得。L-LDHL.乳酸+NAD ' 丙酮酸+NADH水合丙酮酸腺由于酶促反应的专属性,可以避免试样中众多共存组分的干扰,减少繁杂的预处理过程。L-乳 酸脱氢酶催化反应为可逆反应，且反应平衡偏向于丙酮酸转化为乳酸。因此，为了保证反应 平衡偏向于正方向,需加水合肺截获丙酮酸而生成丙酮酸腺,以减少丙酮酸的积累,加快酶促 反应的速度。而水合腓对乳酸脱氧酶又有抑制作用，过量的水合胧反而会降低酶促反应速度。 反应溶液的PH值会影响酶的稳定性，酶活性部位中重要基团的解离状态，酶一底物复合 物以及底物的解离状态，从而影响酶促反应速度。最适PH值为9.20最适温度为37C 发现Ni2+、Mn2+、Cu2+> Cr3+、CO2+对酶促反应速度有抑制作用根据米氏方程,lv1/c为直线关系,因此用双倒数作图法所绘1/v1/c线作为测定乳酸的 标准曲线，线性范围较宽：1.2 X I(M2.0 × 10-3molL。步骤：1 .配制50ml的甘氨酸缓冲液:3.75g,St2.6g.,E D T A2 N a 0.1 g,加适量去离子 水用IOmOl/LNaO H溶液调整PH至9.3,再加去离子水至50 ml2 .配制5ml2.1moll的硫酸钺溶液，吸取0.8ml置于乳酸脱氢酶中进行稀释3 .称量NAD0.01658g (663.4)溶于5ml蒸储水瓶中(5mM), 4保存至少可用2周4 .在PCr小管中加入100 1的甘氨酸缓冲液，100 INAD+,20 Ul不同浓度的乳酸锂，2 1的乳 酸脱氢酶溶液，置于37°C中反应1小时后，用石英比色皿在340nm处测定吸光度，以乳酸锂 浓度为横坐标，A340为纵坐标绘制标准曲线5 .在Per小管中加入IoOHl的甘氨酸缓冲液，100 HINAD+,20 Pl不同时间段的进行适当稀释 的发酵液，2 l的乳酸脱氢酶溶液，置于37中反应1小时后，用石英比色皿在340nm处测 定吸光度，利用标准曲线得出稀释后的发酵的乳酸根含量