高密度脂蛋白对氧化型低密度脂蛋白刺激下脂肪细胞TNFα表达的影响.docx

高密度脂蛋白对氧化型低密度脂蛋白刺激下脂肪细胞TNF表达的影响谢湘竹'，赵水平2,于碧蓬'，钟巧育？(100853北京，解放军总医院南极心血管科'：MOOIl长沙，中南大学湘雅：医院心内科(摘要)目的：观察高密度脂蛋白(HDL)对氧化型低密度脂蛋白(OxLDL)剌激卜,3T3-LI脂肪细相肿痛坏死因子-a(TNFa>mRNA表达的影响,并探讨其可能的作用机制,方法：3T3-L1脂肪细胞促分化成熟后,oxLDL刺激脂肪细胞，给予不IsJ浓度的HDL(IO-lg1,ml),及H89<10M>+HDL(lgml)干预，收集细胞，测定脂肪细胞TNFamRNA表达水平,IKB蛋白浓度及核因子-KB(NF-KB)活性。结果：ONLDL剌激使3T3-LI脂肪细胞TNFamRNA表达及NF-KB活性明隘增强.HDL浓度依赖性抑制TNFamRNA表达、NF-KB活化和IKB降解.与OXLDL刺激组比较，10()gm1HDL使TNFamRNA表达降低64.5%,NF-KB活性减少49%,并明显增加IKB蛋白水平.HDL的这些抗炎效应能被蛋白激醒A(PKA)抑制剂H-89部分抑制*论:HDL能抑制ONLDL诱导的3T3-L1膈舫细胞TNFamRNA表达.PKA-IKBNF-B信号通路是其中作用途径之,该效应不需要HDL与OXLDL的直接接触作用.关键词】：脂肪细胞：氧化型低密度脂蛋白：高密度留蛋白：肿倒坏死因子：核因子B:蛋白激葩A中图法分类号)R329.2;R364.5;R977.6文献标志码AEffect-of4Highdensitylipoprotein(WexpressionOfSilDPreSSeSoxidizedlowdensitylipoprotein-inducedtumornecrosisfactor-ain3T3-L1adipocytesXieXiangzhu1j-ZhaoShuiping2-1YuBilian21-ZhongQiaoqing2J-<-lFirstDepartmentofCardiologyinSouthBuilding,_GcnciiilHospitalOfChineSePL?-Ge«e*ttl+kwpHttl,Beijingt100853»hiiw；iDepanmentofCardiology-,theSecondXiangyaHOpitl,一_-带格式的：上标CentralSouthUniversity,ChangSha,HUnanPr。VilKc,T4IOOlI+,HttfHHrChina)LAbstractlObjective:,Ibevaa4e-<leterninetheetTectOfhjahdensitylipoprotein(HDLjonthemRNA带格式的：三体：K比丽Fexpression(Numcrnecr*itacior(x<TN卜)-mRNA-exMeSMoRInQKidiZedInwdenlvIiDnDrQleinIoxLDLj-Stimulated3T3-L1adipocytes，andtoelucidatethepossible，meehaniMHs._Methods:FullyL4带格式的：7体：Hl非加粗格式的：Z体：五号,非加粗differentiated3T3-LIadipocyteswereincubatedinthemediumcontainingvariousconcentrationsofHDL(10-oIOOgml)withoxLDL(50gml)Stimulatedion.wihwithoutH-89(10uM<nolL)Preincubatedion.TNFamRNAexpressionw;WdcieninedbyRT-PCR,LNF-KBactivity心、UnXlbELISA,andIkBproteinIeVelwasIeWedbyWesternWnuingWereevaluated.Results:OxLDLstimulationinducedasignificantincreaseofTNFamRNAandNF-Bactivityin3T3-L1adipocytes.HDLdose-iitdependenUy-inhibitedTNFamRNAexpression,NF-BactivationandIkBdegradationinadosedependentmanner.ComParedWiIhOXLDLSIimUlUlion.TreatntenlWiIhHDLat100gmlresultedinadecreaseOftppreedTNFmRNAexpressionby64.5andhHe4-NF-Bactivationby49%,andanincreaseOfstbHMl-IBPrOleinSigniiic>nU.CCmParedWiththatCfQKLDLMimUIiUedgroup.,heanti-inflammatoryeffectofHDLcouldbewasabolishedbyPKAinhibitorH-89ParliaHy.Conclusion:HDLcouldsuppressTNFamRNAexpressioninOxLDL-StimuIated3T3-L1adipocytesbythroughPKA-IKBa-NF-KBsignalingpathway,withoutanydirectcontactbetweenHDLandoxLDL.Keywordsadipocytes;oxidizedlowdensitylipoprotcin-(*fcD:highdensityIipoprotcin(HDL);tumornecrosislactor-(TNF);nuclearfacior-kappaB(N口KB);proteinkinaseA(PKA)SupfMYledbyIheGenerulPnlgnimolNalxmalNaturalSckiurcFDUndaIkHIChina(>.Cepndingauthv:ZhaoShuiping.Eail:l>9B)国求自然科学魅金而上项目0赵水平，E-mail:动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，H前认但HDL对脂肪细胞炎症反应调节的报道甚少。本研为，炎症反应参与了动脉粥样硬化发生发展的所有阶段TL肿瘤坏死因子-(TNFa)是一种炎症性细胞因子，在动脉粥样硬化的发病机制中具有重要作用。脂肪细胞和脂肪组织参与脂质和能量代谢的同时，还参与了炎症反应，是内源性TNFa的重要来源。氧化型低密度脂蛋白(OXLDL)除了参与形成泡沫细胞外，还在局部慢性炎症反应中起一定的作用，具有明确的致动脉粥样硬化的作用'3与OXLDL相反，高需度脂蛋白(HDL)被认为具有抗动脉粥样硬化及心血管保护作用”，该效应部分地与其抗炎作用有关，但其具体机制尚不十分清楚.研究已经证实HDL参与调节脂肪细胞内脂质代谢，究观察IIDL对oxLDL剌激状态下脂肪细胞炎症因子表达的影响，并探讨其可能的作用机制。1材料与方法1.1 材料3T3-L1前脂肪细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院.辄化型低密度脂蛋白(OXLDL)、高密度脂蛋白(HDL)购自美国Sigma公司，H-89购自Calbiochcm公司.TRIzoI购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒的自美国Promega公司引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。细胞核蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂食用碧云天生物技术研究所提供.NF-KB活性检测试剂盒购自ACtiVCMotif公司,Ami-IKBa及anti-ac(in抗体购自SantaCruz公司.1.2 方法1.2.1 3T3-L1前脂昉细胞培羿、诱导分化与鉴定参见文献“1.2.2 药物干预脂肪细胞分化成熟后，用含0.2%BSA的无血清培养液饥饿疗法24h后，分别用不I可浓度HDL<0、IOx50,100gml>干预细胞，或以H-89(10nwlL)预孵育Ih后再加入HDL(Ioogml)干预.18h后，弃去培养基.以PBS洗涤细胞2次，再加入含500nl。XLDL培养基孵育Ih.收取培养细胞-70C冻存备用.1.2.3 TNFamRNA表达水平的测定用TRIzOl步法提取总RNA,应用RT-PCR法检测TNFamRNA表达水平，引物序列为：上游S-GCCACCACGeTECrG-31卜游51GGTGTGGGTGAGGAGCA-3'.产物342bp：内参GAPDH引物序列为：上游5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3',下游T-TcCACCACCeTGTTGcTGTA-3',产物439bp°PCR扩增条件为：94C预变性3min,94C变性50s,504C(TNFa),58(GAPDH)退火Imin.72Cii伸1min.循环36次，72C终末延伸10min.反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳.浪化乙锭柒色.UVP型凝胶图像分析系统摄图.并分析各组目的基因及GAPDH基因灰度值，以二者的比值代表TNFamRNA的表达像，1.2.4 核蛋白提取及NF-B活性检测使用细胞核蛋白和细胞浆蛋白抽提试剂盒提取核蛋白BCA法定量一70IC保存备用.ELISA法检测NF-B活性.2.5Westernblot检测kB的表达取75g总蛋白进行12%SDSPAGE凝胶电泳,电泳后将蛋白转至PVDF膜上，脱脂刎粉封闭4lC过夜，加入兔抗小圆多克磔IkB抗体室温下作用2h,然后加入跋性瞬酸版标记的羊抗兔-IgG抗体室温作用lh.BClP/NBT显色液显色，5min后蒸馈水终止反应.以6-actin作为内参.1.3 统计学方法以上实骐求复3次。应用SPSSl1.5统计软件包，指标进行正态性检验,正态分布的指标以f±s表示,多个样本间比较采用第因素方差检验.2结果2. 1HDL抑制OXLDL诱导的TNFamRNA表达水平与空白纸比较，oxLDL(50g,ml)刺激使3T3-U脂肪细胞TNFamRNA农达水平增高至2.9倍</><0.001)-HDL星剂段依赖性抑制脂肪细胞OXLDL旃导的TNFamRNA表达，与无HDL干fft时OXLDL诱导的TNFamRNA表达水平比较，10、50、IOOmlHDL分别显著抑制TNFamRNAa:P<0.05.b：P<0.l,与50gmloxLDL比较图IHDL时OXLDL语导的TNFamRNA表达水平的影响3. 2HDL抑制OXLDL介导的NF-KB活化和IKB降解HDL呈剂盘依赖性抑制oxLDL语导的脂肪细胞NFkB活化。与oxLDL刺激组比较，50gml和IOOgmlHDL分别显署抑制NFkB活性35.8%和49%(P<0.05)(图2)。NF-B活化与胞质内NF-KB抑制子IkB的降解相关，出图3可以存出，HDL也呈剂量依赖性抑制IKB降解.MOUlhla*LDL-HDLIooHlaiIgafaia:PVO.05,b：P<O.(X)I,与50gmloxLDL比较图2不同浓度HDL对NF-B活性的影响图3HDL对IKB表达的影响2. 3PKA抑制剂H-89减弱HDL的抗炎效应与单用HDL(100pg.ml)干预oxLDL刺激的3T3-L1脂肪细胞组比较，联合使用PKA抑制剂H-89<10M)和HDL(lg-'ml)干预