红霉素-N-脱甲基酶ERND活性测定试剂盒说明书.docx
红薯素N脱甲基酶(ERND)活性测定试剂盒说明书微量法IooT/48S注意F正式测定之前选择2.3个预期差异大的样本做预测定。渊定意义：细胞色素P450前是一组主要存在于肝脏的酶系，在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物的代谢，具有重要作用。ERND在P450所系中相当于CYP2B亚型，与药物代谢的去甲基化密切相关。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解毒作用，也可使某些药物经CYP2B代谢活化。渊定原理：ERND催化红霉素释放甲醛，通过NaSh比色测定甲醛含量，即可计算出ERND活性。自备仪器和用品:普通离心机，超速离心机、'调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸储水和冰。试剂组成和配置:试剂一：试剂二: 试剂三: 试剂四: 试剂五: 试剂六: 试剂七: 标准液:粉剂Xl瓶,液体Xl瓶, 粉剂Xl管, 粉剂Xl瓶, 粉剂Xl瓶, 液体Xl瓶, 液体Xl瓶, 液体Xl瓶,4C保存。4C保存。4C保存。4C保存。4C保存。4C保存。4C保存。临用前加IOOmL蒸储水溶解。临用前加ImL蒸储水，充分溶解。临用前加0.5mL蒸储水，充分溶解。临用前，加蒸储水4.5mL充分溶解。-20保存。临用前取1.5mLEP管，加入10l标准液，加990l蒸储水，混匀即为0.05mmol/L标准甲醛溶液，49保存。粗液提取：1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入ImL试剂一，冰上充分研磨，10000g4'C离心30min,取上清液，转入超速离心管中。2、粗制微粒体：IOOOOOg,4C,离心60min,弃上清液。3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加ImL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，1000Oog离心30min,弃上清液。4、最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL,充分震荡溶解，即粗筋液，待测。该待测液需当天使用。泅定操作，1 .分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到412nm,蒸储水调零。2 .试剂二置于37'C水浴中预热30min。3 .对照管,取0.5mLEP管，加入10L粗酶液，170L试剂二，10L试剂三，10L蒸储水，混匀后置于37C水浴保温30min;立即加入35L试剂五，混匀后置于冰浴中5min：取出后加入35L试剂六，混匀后室温静置5min:室温800OrPm离心5min；取新的EP管，加入100L上清液，100L试剂七，混匀后60水浴IOmin,然后取出，用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收，记为A对照管。4 .测定管：取05mLEP管，加入10L粗酶液，170L试剂二，10L试剂三，10L试剂四，混匀后置于37C水浴保温30min;立即加入35L试剂五，混匀后置于冰浴中5min：取出后加入35L试剂六，混匀后室温静置5min；室温8000rpm离心5min：取新EP管，加入100L上清液，100L试剂七，混匀后60,C水浴IOmin,然后取出，用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收，记为A测定管。5 .标准管：取0.5mLEP管，加入100L标准品，100L试剂七，混匀后60水浴Iomin,然后取出，用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收，记为A标准管。注意：每个样品都需要做对照管。ERND活性计算公式：a使用微量石英比色皿测定的计算公式如下（1） .按照蛋白浓度计算：活性单位定义：37°C下，每分钟每毫克蛋白催化产生Inmol甲醛为1个酶活单位。ERND活性（nmol/min/mgprot）=C标准品XV标准品X（A测定管一A对照管）÷A标准管X稀释倍数÷（CprxV样）÷T=45×（A测定管一A对照管）÷A标准管÷Cpr.（2） .按照样本质量计算：活性单位定义：37下，每分钟每克样品催化产生Inmol甲醛为1个酶活单位。ERND活性（nmol/min/g鲜重）=C标准品XV标准品X（A测定管一A对照管）÷A标准管X稀释倍数÷（W×V样）÷T=45×（A测定管一A对照管）÷A标准管÷WC标准品:0.05mmolL=50molL;V标准品：100L=lX104L;稀释倍数:V反总÷V上清液=（50+850+50+50+175+175）÷500=2.7：Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mgmL）,需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量，g：V样：加入粗酶液体积，10L=0.0hnL:T：催化反应时间（min）,30minb.使用96孔板测定的计算公式如下（1） .按照蛋白浓度计算：活性单位定义：37C下，每分钟每亳克蛋白催化产生InmOl甲醛为1个酶活单位。ERND活性（nmol/min/mgprot）=C标准品XV标准品X（A测定管一A对照管）÷A标准管X稀释倍数÷（CprxV样）÷T=45×（A测定管一A对照管）÷A标准管÷Cpr.（2） .按照样本质量计算：活性单位定义：37C下，每分钟每克样品催化产生Inmol甲醛为1个酶活单位。ERND活性（nmol/min/g鲜重）=C标准品XV标准品X（A测定管一A对照管）÷A标准管X稀释倍数÷（W×V样）÷T=45×（A测定管一A对照管）÷A标准管÷WC标准品：0.05mmolL=50molL;V标准品：100L=1X10"L：稀释倍数：V反总÷V上清液=（50+850+50+50+175+175）÷500=2.7：Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mgmL）,需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量，g；V样：加入粗酶液体积，10L=0.0lmL:T：催化反应时间（min）,30min<>
