化妆品中他克莫司和吡美莫司的测定（BJH 202301）.docx

BJH化妆品补充检验方法BJH202301化妆品中他克莫司和口比美莫司的测定国家药品监督管理局发布化妆品中他克莫司和毗美莫司的测定(BJH202301)1范围本方法规定了化妆品中他克莫司和毗美莫司的测定方法。本方法适用于膏霜乳类、液体(水、油)类化妆品中他克莫司和毗美莫司的定性和定量测定。2方法提要样品经甲醇超声提取后，采用高效液相色谱仪分离，质谱检测器检测。根据保留时间和特征离子对丰度比定性，待测组分相对应离子峰面积定量，以标准曲线法计算含量。3试剂与材料除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯及以上规格，水为符合GB/T6682规定的一级水。3. 1甲醇，色谱纯。3.2 乙酸铉，色谱纯。3.3 乙酸，色谱纯。3.4 含0.1%乙酸-5mmolL乙酸筱的水溶液：准确称取0.3854g乙酸筱(3.2),加入1.OmL乙酸(3.3),用水溶解并稀释至IOoOmL,混匀。3.5 含0.现乙酸-5mmolL乙酸钱的甲醇溶液：准确称取0.3854g乙酸镂(3.2),加入1.OmL乙酸(3.3),用甲醉(3.1)溶解并稀释至IooOnlL,混匀。3.6 标准品：他克莫司、毗美莫司的标准品纯度均295.0%,标准品的中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量、结构式见附录A中的表A.1。3.7 标准储备溶液：称取他克莫司、毗美莫司标准品各IOnlg(精确到0.00001g),分别置于IOnIL棕色容量瓶中，用甲醇(3.1)溶解并定容至刻度，混匀。制成标准储备溶液的质量浓度均为1OOOmgZLo置于-18冰箱中保存。3. 8混合标准储备溶液：准确移取他克莫司、毗美莫司标准储备溶液（3.7）O.IniL置于IOmL容量瓶中，用甲醇（3.1）稀释至刻度，摇匀。制成浓度为10mgL的混合标准储备溶液。置于-18C冰箱中保存。4仪器与设备4. 1高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪。4.2 分析天平：感量0.00天g和0.000OIgo4.3 超声波清洗器。4.4 泯旋混合仪。4.5 高速离心机。5试样制备与保存样品应按照标签标示的贮存条件进行保存。取样前，应检查封口的完整性，观察样品的性状和特征，并使样品混匀。打开包装后，应尽可能快地取出所要测定部分进行分析，取样后，应将样品进行密封保存。6分析步骤1.1 筛查用混合标准溶液取混合标准储备溶液（3.8）适量，用甲醇（3.1）进行稀释，配制成他克莫司、Itt美莫司浓度为1.0g/L的筛查用混合标准溶液。1.2 空白基质提取液称取空白试样02g（精确到0.0001g）,置于IOmL具塞比色管中，自“加入8mL甲醇”起与样品同法处理（6.5）,作为空白基质提取液。1.3 基质混合标准中间溶液准确量取混合标准储备溶液（3.8）0.ImL置于IOmL容量瓶中，用空白基质提取液（6.2）稀释至刻度，摇匀，制成他克莫司、口比美莫司浓度为100Pg/L的基质混合标准中间溶液。1.4 基质混合标准系列溶液分别精密量取基质混合标准中间溶液（6.3）适量，用空白基质提取液（6.2）配制浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、20、50Pg/L的基质混合标准系列溶液。基质混合标准系列溶液应现用现配。称取混合均匀的试样约0.2g（精确至0.00Olg）于IomL具塞比色管中，加入8mL甲醇（3.1）,于涡旋混合仪上振荡30s至试样与提取溶剂混合均匀。超声提取15min,静置至室温，然后用甲醇（3.1）定容至刻度，摇匀，以4000r/min离心5min,上清液经0.22Pm滤膜滤过，滤液作为供试品溶液备用（供试品溶液可根据实际浓度进行适当稀释）。6. 6仪器参考条件7. 6.1色谱条件色谱柱：C18柱（2.ImmX100mm,1.7m）,或等效色谱柱；流动相：A为含0.1%乙酸-5mmolL乙酸核的水溶液，B为含0.1%乙酸-5mnolL乙酸铁的甲醇溶液。梯度洗脱程序见表1。流速：0.3mLmin;柱温：45；进样量：2nL°表1梯度洗脱程序时间(min)流动相A（%）流动相B（%）0.0070300.5070303.0030708.0029811.0029811.30703015.0070308. 6.2质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESl源）；监测模式：正离子多反应监测模式（MRM）,监测离子对及相关参数设定见表2。表2他克莫司、毗美莫司监测离子对及相关参数设定组分名称母离子（血4）子离子（mz）CE(eV)768.6*20他克莫司821.6576.427774.6*23毗美莫司827.6564.427为推荐的定量离子。注：当采用不同质谱仪器时，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。取供试品溶液（6.5）与筛查用混合标准溶液（6.1）在相同分析条件下测定，样品中如呈现定量离子对和定性离子对的色谱峰,被测成分的特征离子峰保留时间与筛查用混合标准溶液（6.1）对应的保留时间一致，且选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度的筛查用混合标准溶液（6.1）的监测离子对的相对丰度比的最大偏差不超过表3的规定，则可以判定样品中存在对应的组分。表3定性确证时相对离子丰度比的最大允许偏差相对离子丰度（k）k>50%50%>k>20%20%>k>10%k10%允许最大偏差±20%±25%±30%±50%6. 8定量测定取基质混合标准系列溶液（6.4）依次测定，以待测组分的系列浓度为横坐标，待测组分的峰面积为纵坐标，进行线性回归，绘制基质标准曲线，其线性相关系数应大于0.99。取供试品溶液（6.5）测定，将对应的定量离子对色谱峰面积代入基质标准曲线。按“7”项下公式，计算样品中待测组分的含量。6. 9平行试验按以上步骤，对同一样品进行平行实验测定。6.10空白试验除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。7结果计算结果按式（1）计算：pXVXDsmVT式中：3一样品中他克莫司、口比美莫司的质量分数，mg/kg；。一供试品溶液中他克莫司、毗美莫司的质量浓度，Ug/L；?一样品定容体积，mL；m一样品取样量，g；。一稀释倍数（如未稀释则为1）。在相同条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%o8精密度与准确度多家实验室验证回收率为80%120的相对标准偏差小于10%（n=6）o9检出限和定量限本方法中他克莫司、毗美莫司的检出限、定量下限及取样量为0.2g时的检出浓度、最低定量浓度见表4。表4他克莫司、毗美莫司的检出限、定量下限、检出浓度和最低定量浓度组分名称检出限(ng)定量下限<ng)检出浓度(mgkg)最低定量浓度(mgkg)他克莫司0.00040.0010.010.025毗美莫司0.00040.0010.010.02510图谱图1他克莫司标准溶液的多反应监测色谱图图2毗美莫司标准溶液的多反应监测色谱图附录A他克莫司、毗美莫司的相关信息表A.1他克莫司、毗美莫司的中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量及结构式中文名称英文名称CAS号分子式相对分子质量结构式他克804.02Tacrolimus104987-11-3CYHgNO*莫司毗美Pimecrolimus137071-32-0CJhNOi1Cl810.45莫司起草单位：山东省食品药品检验研究院主要起草人：李启艳、王维剑、牛水蛟、于海英验证单位：中国食品药品检定研究院、上海市食品药品检验研究院、深圳市药品检验研究院