脱细胞技术在气管组织工程构建中的应用展望.docx

脱细胞技术在气管组织工程构建中的应用展望王尧，钱军综述孙云浩，季明明隈，朱敏»按，许建宁审校南京大学医学院附属盐城第一医院工盐城市第一人民医院上胸心外科江苏盐城.224005基金项目：江苏省卫生健康委医学科研项目(Z):江苏省科协青年科技人才托举工程(2020)；盐城市医学科技发展计划项目(YK)【摘要】近年来，脱细胞技术在气管组织工程的研究与应用己经成为当前的热点，并取得了一些进展。但是如何更好地将脱细胞气管基质应用于临床仍需要深入的研究。本文将对气管组织工程中不同脱细胞技术的优缺点及在长段气管损伤中的应用进行综述，并对未来的研究进行展望。【关键词】脱细胞技术：气管组织工程；脱细胞气管基质；长段气管损伤JJaMApplicationandprospectof(ICCelIUIariZatiOntechnologyintissueengineeredtracheaWANGYao,QlANJun,SlJNunYunhaofJIMingming,ZHlMing,XL.IianningDePartmentOfCardiothoraCiCSurgery,YangChengFirSlHOSDitaLAffiIiatedHoSDitalOfNanjingUniVerSiIyMediCalSCiK)OLYanCheng224005.Jiangsu,CHlNAAbstractInrecentyears.Scientistspaidcloseattentiontothestudiesandapplicationsofdecellularizationtechnology,whichhavemadesomeadvancesDrogress.Buthowtopromotedecellularizedmatrixforclinicalapplicationstillneedsdeeperresearch.Herewesummarizedtheadvantagesanddisadvantagesofdifferentacellulartechniquesintissueengineeredtracheaandtheirapplicationsinlongtrachealinjurytherapyandprovidedaguidanceoffurtherinvestigations.keyworddecellularizationtechnology;tissueengineeredtrachea;-decellularizedmatrix;longtrachealinjury：progressFundprogram:MedicalResearchProjectofJiangsuCommissionofHealth(Z);第一作者：王尧，1985年U月，男,盐城，主治医师，博士，,通讯作者：许建宁,1982年7月.盐城,副主任医师,硕士，,TalentSupportProjectofJiangsuAssociationforScienceandTechnology(2020);ProgramofMedicalScienceandTechnologyinYancheng(YK)气管切除并端端吻合是当前气管重建的金标准，但仅限于病变气管段不超过成人总气管长度1/2或小儿1/3”一文当病变气管超过最大限度时，进行气管重建有一定难度，因为气管不仅仅是一个简单的圆柱状通气管道，而是由复杂的多层结构组成。气管是由15-20个C形软骨构成，在气管内表面覆有纤毛上皮，外表面含有平滑肌、血管等结缔组织。气管软骨维持着气管圆柱状形态，防止气管塌陷；而气管内表面呼吸上皮中的纤毛对气管的清洁有着重要作用；气管软骨周围的结缔组织则保证了气管的曲伸及收缩、扩张等机械运动刀。因此，还没有办法完全重建这样复杂的多层结构以及完全模拟其功能。目前在气管组织工程构建中常用技术是脱细胞与3D打印技术，本文主要对脱细胞技术在组织工程气管中的研究进展进行综述。1脱细胞技术1.通过化学和生物酶、物理或组合方法去除组织/器官内的细胞成分，有效地保留组织/器官的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)及三维结构；同时诱导并促进细胞的增殖、分化、粘附，最终重建或修复组织/器'白,原本的功能四小2脱细胞方法2化学方法_L利用去污剂、酸碱溶液等化学试剂处理组织/器官，通过溶解细胞膜和解离细胞内部结构，同时完整保留细胞外基质，从而达到脱细胞的目的lioL理想的化学脱细胞试剂应具有毒性低、清除细胞效率高及最大程度保留基质生物力学特性等优点。TritonX-Io0、十二烷基硫酸钠(SodiUmdodecylSUIPhate,SDS)与脱氧胆酸钠(deoxycholate,SD)是脱细胞过程中最常用的脱细胞试剂ULSDS是最广泛使用的离子型去污剂，它通过溶解细胞膜和核膜起作用，能完全去除细胞及消除至少90%宿主DNAo但SDS在脱细胞同时使基质血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)和糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量减少，弹性模量减低，且SDS具有细胞毒性，组织脱细胞后需要进行反复的清洗后才能接种细胞0-网。SD是另一种离子型去污剂，通过溶解细胞膜起作用，与SDS相比，SD不会破坏基质结构且毒性低，但会导致DNA凝集在组织表面。TritonX-IOo是一种非离子型去污剂，可以通过其分子上的亲水基团溶解细胞而达到清除血管壁细胞成分的目的。相比SDS,TritonX-100对组织结构完整性的损害及细胞毒性较小，但清除细胞能力欠佳”也三种常用化学脱细胞试剂都有各自不足，须与物理方法及酶等方法联合使用才能达到理想的脱细胞效果。2.2 生物方法用胰蛋白酶、核酸酶等来处理组织/器官，清除细胞DNA及细胞外基质中的某些成分来达到脱细胞效果”叫酣处理时间过长或浓度过高，可显著改变基质结构，破坏层粘连蛋白并去除GAG,严重损害基质的生物力学性能。因此，为了制备优质的脱细胞基质，酶常与化学脱细胞试剂联合使用。Zhang等I网联合使用胰蛋白酶、SDS.TritonX-IoO对猪腹直肌进行脱细胞处理后发现细胞和DNA被充分去除，层粘连蛋白、IV型胶原和纤连蛋白得以完整保留。同时，脱细胞肌肉显示出与天然肌肉相似的机械强度，超微结构、脉管系统和神经通道也完好无损。同样，先用TrilOnX-IOo及SD对人肺进行脱细胞处理后再用脱氧核糖核酸酶处理，结果发现残留DNA被完全清除，从而避免了体内潜在的免疫反应1。2.3 物理方法二-0借助超声波、冻融、高压与超临界二氧化碳等方法来脱细胞，通过溶解细胞和破坏细胞基质粘附蛋白来达到消除细胞的目的。冻融法呼却是最常用的物理方法，通过冷冻组织，形成细胞内结晶，破坏细胞膜，导致细胞溶解。但该方法必须控制温度变化速率，控制形成冰晶的大小，防止对ECM的过度损伤。高压法是通过对组织施加压力来达到溶解细胞的目的，但这种方法只对ECM致密的组织或器官有效（如肝和肺）。超声波法田-241是运用超声波在液体中的空化作用，以及强烈的振动与搅拌作用，将细胞击碎。但是，目前尚未研究出破坏细胞时超声波的最佳幅度和频率。超临界二氧化碳法磔-23是一种有前景的方法，由于超临界二氧化碳具有类液体的密度和类气体的扩散率，其临界温度为3I.1C,临界压力为7.40MPa,与生物系统兼容。该方法优点在于二氧化碳不会留在组织内，因此不需要大量清洗。然而，二氧化碳是非极性的，需要加入极性夹带剂（如乙醇）来去除细胞的极性磷脂膜，从而清除细胞核和膜。所有的物理方法优点在于可以避免化学试剂或前的毒性，减少对ECM的损害，但缺点在于需要反复清洗才能去除残留的细胞碎片及DNA,避免免疫排斥反应。因此，物理方法需要结合化学或生物方法才能进一步提高脱细胞效率。带格式的：字体:加粗3脱细胞技术在气管组织工程构建中的应用脱细胞气管基质不仅具有无免疫原性、无毒性、良好的生物相容性，同时还保留原生气管的三维结构和细胞外基质，是长段气管缺损修复的理想支架材料。3.1 脱细胞技术在动物实验中的应用一Jiang等网采用2%TritOnX-100联合脱氧核糖核酸酶I和核糖核酸酶对兔气管进行脱细胞处理，组织学分析表明粘膜上皮细胞成分基本被去除，软骨细胞少量残留；扫描电镜结果显示气管内表面无细胞残留，基底膜光滑，有轻微破坏。同样，Zhang等国吩别使用1%、2%、3%、4%TritonX-IOo和核酸前对兔气管进行脱细胞处理,组织学与扫描电镜结果显示经2%TritonX-100和核酸酶处理的气管纤毛上皮细胞完全消失，软骨细胞大量保留，基底膜完整。异体皮下埋植实验证实了脱细胞气管基质无免疫原性，具有良好的生物相容性。细胞共培养实验表明脱细胞气管基质提供的微环境有利于细胞增殖。因此，2%TritonX-Ioo处理制备的脱细胞气管基质具有良好的力学性能和生物相容性，可于气管损伤的修复重建。Kajbafzadeh等州将十二烷基硫酸钠制备的脱细胞气管植入裸鼠体内，利用其自身作为天然生物反应器，结果证实了脱细胞气管基质的组织结构得以保留，并具有良好的生物力学性能。移植后3、6和12个月获取的活检样品中软骨成分和结缔组织中的细胞播种程度均较高。Fabio等囱提出了一种使用双室生物反应器使气管移植物去上皮化并随后用外源细胞重新填充移植物的新颖方法。他们首先用十二烷基硫酸钠通过内室灌注3小时可有效去除大部分气管上皮细胞，同时经生长培养基灌注的外室可使大部分软骨细胞存活丁最后使气管移植物重新上皮化。这项研究将脱细胞技术与生物反应器结合制备气管移植物，既保留了移植物的结构和机械性能，同时保持了软骨的活力，并随后实现了细胞附着和再填充。上述研究都为进一步原位气管移植提供了一些基础，但仍需要长期的实验研究，将来才有望应用于临床。Giraldo-Gomez等网使用胰蛋白酶法对长段猪气管进行脱细胞处理，HE染色与DNA残留含量定量分析表明气管腔内无细胞成分及DAN含量明显减少JL抗原性消失；扫描电镜显示胶原纤维在软骨周围组织中保留下来：生物力学结果证实脱细胞气管基质与正常气管两者的机械性能无显著性差异；细胞跟踪和活力分析显示软骨细胞在接种8天后依然保持软骨细胞特征形态及活力。该研究表明胰蛋白酶制备的脱细胞气管基质可作为气管替代物，但体内移植效果需要进步的实验研究来验证。Ohna等网利用高静水压技术运行对猪气管进行脱细胞处理后进行体内移植，术后6个月和12个月研究发现气管腔被脱细胞气管补片修复，周围有再生软骨，部分均匀地结合到脱细胞气管补片中，诱导了气管重构。但是过高的压力会导致蛋白质变性，影响脱细胞气管基质的生物力学性能，因此，选择合适的压力至关重要。1.ange等网通过将真空脱细胞法制备的脱细胞猪气管，与正常气压下制备的脱细胞猪气管进行对比，结果显示：与对照组相比，真空脱细胞法制备的脱细胞气管完全清除纤毛上皮细胞和软骨细胞，残留的DNA少，胶原蛋白、糖胺聚糖含量及生物力学性能无明显差异。随后，他们将用真空脱细胞法制备的脱细胞人气管埋植到大鼠体内14天，研究发现气管支架均保持良好的形态，未出现免疫排斥反应等不良反应。Bulter等画将通过真空脱细胞法制备的脱细胞人气管与去污剂联合酶法所制的脱细胞人气管进行比较，研究发现两者脱细胞效果相似，鸡绒毛尿囊膜和皮下植入实验证实了脱细胞气管基质不仅促进血管向内生长，同时具有较好的生物相容性。真空脱细胞法制备周期短(约9天)，成本相对较低，但在负压影响下组织结构会发生膨胀，且细胞粘附情况、糖胺聚糖丢失影响、原位移植效果仍需要通过实验来进一步研究，最终形成真空脱细胞法的标准程序以便将来应用在临床上解决气管替代物缺乏的难题。3.2脱细胞技术在临床中的应用二EHiott等网报道了一例12岁患儿因长段先天性