蛋白质样品的制备24.ppt

2蛋白质代谢测定 （1）吲哚试验（）吲哚试验（Indol test）：）：含有色氨酸酶的细菌（如大肠杆菌、变形杆菌等）可分解色氨酸色氨酸生成吲哚，若加入二甲基氨基苯甲醛，与吲哚结合，形成玫瑰吲哚，呈红色，称吲哚试验阳性。（2）硫化氢试验：变形杆菌、乙型副伤寒杆菌等能分解含硫氨基酸含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氢。在有醋酸铅或硫酸亚铁存在时，则生成黑色硫化铅或硫化亚铁，可借以鉴别细菌。I-I-吲哚（吲哚（indolindol）试验）试验色氨酸色氨酸吲哚吲哚玫瑰吲哚玫瑰吲哚 吲哚试剂吲哚试剂 -+IMViC试验I-吲哚（indol）试验M -甲基红（methyl red）试验V -VP（Voges-Proskauer）试验C -枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验IMViC试验 细菌的生化反应用于鉴别细菌，尤其对形态、革蓝氏染色反应和培养特性相同或相似的细菌更为重要。吲哚（I）、甲基红（M）、VP（V）、和枸橼酸试(C)验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验试验 I M Vi C试验 大肠埃希菌 +-产气杆菌 -+硫化氢试验 +（FeS黑色）尿素酶试验3尿素分解试验 变形杆菌具有尿素酶，可分解尿素产生氨，培养基呈碱性，以酚红为指示剂检测呈红色，由此区别于沙门氏菌。幽门螺杆菌C14尿素呼气检测试验 气相、液相色谱法气相、液相色谱法通过对细菌分解代谢产物中挥发性或不挥发性有机酸和醇类的检测，可准确、快速地确定细菌的种类，是目前进行细菌生化鉴定的高新技术。合成代谢产物细菌通过新陈代谢不断合成菌体成分，如多糖、蛋白质、脂肪、核酸、细胞壁及各种辅酶等。此外，细菌还能合成很多在医学上具有重要意义的代谢产物。热原质热原质（pyrogen）细菌合成的一种注入人体或动物体内能引起发热反应的物质。LPS 耐高温 去除方法：250干烤、蒸馏、吸附剂等 制备和使用注射药品过程无菌操作 毒素与侵袭性酶 色素 抗生素 某些微生物代谢过程中产生的一类能抑制或杀死某些微生物或肿瘤细胞的物质 细菌素 维生素毒素与酶：细菌可产生内、外毒素及侵袭性酶，与细菌的致病性密切相关。内毒素内毒素（Endotoxin）即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为类脂A。菌体死亡崩解后释放出来。外毒素外毒素(Exotoxin)是由革兰氏阳性菌及少数革兰氏阴性菌在生长代谢过程中释放至菌体外的蛋白质。具有抗原性强、毒性强、作用特异性强的突出特点。某些细菌可产生具有侵袭性的酶，能损伤机体组织，促进细菌的侵袭、扩散，是细菌重要的致病因素，如链球菌的透明质酸酶等。色素（Pigment）：有些细菌能产生色素，对细菌的鉴别有一定意义 细菌色素有两类：水溶性色素水溶性色素，能弥散至培养基或周围组织，如绿脓杆菌产生的绿脓色素使培养基或脓汗呈绿色。脂溶性色素脂溶性色素，不溶于水，仅保持在菌落内使之呈色而培养基颜色不变，如金黄色葡萄球菌色素。细菌色素的产生需一定条件（营养丰富、氧气充足、温度适宜），无光合作用，对细菌的功能尚不清。抗生素抗生素（Antibiotic）:某些微生物代谢过程中可产生一种能抑制或杀死某些其他微生物或癌细胞的物质，称抗生素。抗生素多由放线菌和真菌产生，细菌仅产生少数几种，如多粘菌素（Polymyxin）、杆菌肽(Bicitracin)等。链霉素链霉素红霉素青霉素作用青霉素作用位点位点 细菌素（Bactericin）:某些细菌能产生一种仅作用于有近缘关系的细菌的抗菌物质，称细菌素。细菌素为蛋白类物质，抗菌范围很窄，无治疗意义，但可用于细菌分型和流行病学调查。细菌素以生产菌而命名。大肠杆菌产生的细菌素称大肠菌素，绿脓杆菌产生的称绿脓菌素，霍乱弧菌产生的称弧菌素。细菌的人工培养 人工培养细菌需要的条件：充足的营养和能量；酸碱度；渗透压；温度；必要的气体细菌的人工培养 根据不同的标本及不同的培养目的，可选用不同的接种和培养方法。分离培养：纯培养：第三节 细菌的人工培养 植物病原细菌一般用稀释分离法，稀释培养可以使病原细菌与杂菌分开，形成分散的菌落，容易分离得到纯培养。培养皿稀释分离法：平板划线分离法：常用分离方法 稀释分离法：主要用于分离细菌和酵母等。是直接将病组织上的孢子洗下配成孢子悬浮液，经稀释后与溶化并冷却到45左右的培养基混合，然后倒在灭菌的培养皿中。病组织是不经过表面消毒的，可能带来叫多的杂菌。组织分离法：就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移入培养基平板上培养。细菌的人工培养 培养基（culture medium）由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品 培养基的分类：基础培养基（basic medium）增菌培养基（enrichment medium）选择培养基（selective medium）鉴别培养基（differential medium）厌氧培养基（anaerobic medium）液体培养基 固体培养基 半固体培养基 按成分不同划分按成分不同划分 天然培养基天然培养基(complex medium)：凡是利用来自生物的组织、器官以用它们的抽提物或制品制成的培养基。如：牛肉汁、玉米粉、米糠。其化学成分还不清楚或化学成分不恒定，也称化学限定培养基。如：牛肉膏蛋白胨培养基等。合成培养基合成培养基(synthetic medium)是由化学成分完全了解的物质(化学药品)配制而成的培养基。也称化学限定培养基。如：高氏一号培养基等。为了研究和利用微生物，必须人为地创造适宜的环境培养微生物，培养基是指经人工配制而成的适合微生物生长繁殖和积累代谢产物所需要的营养基质。我们配制培养基不但需要根据不同微生物的营养要求，加入适当种类和数量的营养物；并要注意一定的碳氮比例（C/N）；还要调节适宜的酸碱度（pH）；保持适当的氧化还原电位和渗透压。按成分不同划分按成分不同划分 半合成培养基半合成培养基：采用天然有机物作为N源和生长物质，再添加一部分的化学药品作为C源和无机盐来源的培养基。天然培养基天然培养基：成本低，生长量好，工业上常采用；合成培养基：合成培养基：成本高，生长缓慢，但研究代谢途径是必需用的。按用途划分按用途划分 基础培养基基础培养基(minimum medium)是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。如：细菌牛肉膏蛋白胨；酵母菌麦芽汁；真菌马铃薯蔗糖培养基（PDA）。选择培养基选择培养基(selectivemedium)是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。(SS培养基、MS培养基)选择培养基选择培养基 一种类型选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的（相当于加富培养基）。另一类选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物，例如：泡菜的制作（高盐）选择培养基选择培养基 Martin培养菌富集土壤真菌用，含有链霉素或金霉素等抗生素。Ashhy无氮培养基富集好氧自生固氮菌。含有缓冲剂和碳酸钙或硫酸钙。青霉素可抑制革兰氏阳性细菌的生长；加多粘霉素B可以抑制革兰氏阴性细菌的生长；加链霉素或氯霉素可以抑制大部分细菌的生长。分离土壤植物病原细菌使用放线菌酮（环已酰胺）或新霉素。