蛋白质的SDSPAGE电泳.ppt

蛋白质的蛋白质的SDSPAGESDSPAGE电泳电泳12电泳原理3电泳中的不正常现象4目录目录 发展历史，分类样品处理 PAGE胶 发展历史发展历史1.1967年由Shapiro建立2.1969年由Weber和Osborn进一步完善3.目前已成为分子生物学实验中常用的一项技术分类分类根据缓冲体系和凝胶孔径的不同：连续电泳不连续电泳根据样品的处理方式不同：还原SDS电泳非还原SDS电泳带有烷基化作用的还原SDS电泳目前实验室常用不连续的还原SDS垂直电泳根据电泳形式：圆盘电泳垂直电泳水平电泳平板电泳垂直电泳装置垂直电泳装置不连续电泳用浓缩胶（上层胶）和分离胶（下层胶）两种不同浓度，不同PH值的凝胶灌制凝胶板，通过电荷效应，浓缩效应，分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离样品样品缓冲液应包含以下部分：SDS（十二烷基磺酸钠）巯基乙醇（BME）溴酚蓝 丙三醇 pH=6.8Tris-glycineSDS作用：断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，与蛋白质以一定比例结合，从而使蛋白质带上负电荷并具有相同的质合比，在电泳时迁移速率仅与分子量有关巯基乙醇（BME）阻止半胱氨酸氧化并打开二硫键SDS-PAGE测定的是蛋白质亚基的分子量溴酚蓝 丙三醇溴酚蓝是一种染料，能够与蛋白质结合显示蛋白质的运动轨迹丙三醇的密度比水大，使样品沉淀到加样槽底部PAGE胶丙烯酰胺（Acr）:形成聚合物链甲叉双丙烯酰胺（Bis）：交联剂，形成纵向桥架过硫酸铵（AP）：引发剂，产生自由基N，N，N，N四甲基乙二（TEMED）：催化过硫酸铵产生自由基，加速聚合%T=total monomer concentration Acr+Bistotal volumeX 100%孔徑平均大小孔徑平均大小%acrylamide孔洞大小决定于（1）Acr与Bis的总量（2）Bis的用量：架桥程度分离胶 浓缩胶 电泳液三大特色：PH不连续凝胶浓度不连续缓冲液成分不连续ATTENTION:不同的PH，氯离子，甘氨酸将会在电泳过程中发挥重要作用工作原理工作原理蛋白质进入分离胶之前，先堆积成一条细线，使每个分子蛋白质进入分离胶之前，先堆积成一条细线，使每个分子起跑点相同，提高解析度起跑点相同，提高解析度分离胶内的电分离胶内的电泳泳按分子量大小进行按分子量大小进行分离分离检测检测考马斯亮蓝染色银染色考马斯亮蓝R250红蓝色，每个分子含有两个SO3H,偏酸性，结合在蛋白质的碱性基团上染色结果银染色机制：将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使银颗粒沉积在蛋白带上应用应用蛋白质分子量的测定 蛋白质纯度分析蛋白质浓度测定 蛋白质水解的分析免疫沉淀蛋白的鉴定 免疫印记第一步蛋白质修饰的鉴定 分离和浓缩用于产生抗体的抗原分离放射性标记的蛋白电泳过程中的不正常现象电泳过程中的不正常现象1“微笑”现象指示剂前言呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好2 皱眉现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当明胶和玻璃板组成的“三明治底部有气泡”或靠近隔片的凝胶聚合不完全3“拖尾”现象样品溶解不佳引起解决办法：加样前离心选择合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液加增溶试剂降低凝胶浓度4“纹理”现象样品中的不溶性颗粒引起的解决办法：增加溶解度离心除去不溶性颗粒5 偏斜现象电极放置不平行或加样位置偏斜引起6 带太宽加样量太多或者加样孔泄露引起THANK YOU!