高速逆流色谱.ppt
高速逆流色谱高速逆流色谱一、概述一、概述高速逆流色谱（高速逆流色谱（High-Speed CountercurrentHigh-Speed Countercurrent Chromatography,HSCCC Chromatography,HSCCC）是一种连续高效的）是一种连续高效的液液-液分配色谱分离技术液分配色谱分离技术。该技术不需要。该技术不需要固体支撑固体支撑体体，主要依据物质在，主要依据物质在两相中分配系数的不同对物两相中分配系数的不同对物质进行分离质进行分离，相对其他常用色谱（如柱色谱、高，相对其他常用色谱（如柱色谱、高效液相色谱等）来说，具有效液相色谱等）来说，具有无不可逆吸附无不可逆吸附和和回收回收率高率高的特点，特别适合于的特点，特别适合于天然活性成分天然活性成分的分离。的分离。HSCCCHSCCC技术最早是由美国国立卫生院技术最早是由美国国立卫生院Ito博士博士研研制应用，我国对制应用，我国对HSCCCHSCCC技术应用较早，技术应用较早，HSCCCHSCCC技技术发展十分迅速，在过去术发展十分迅速，在过去2030年中，出现了年中，出现了一系列新型的分离技术，积累了大量的科研成一系列新型的分离技术，积累了大量的科研成果，自果，自19951995年以来，国外已有年以来，国外已有5 5本本英文专著出英文专著出版，我国目前也有版，我国目前也有两本两本中文专著出版。中文专著出版。二二、HSCCC色谱色谱工作原理工作原理 HSCCC HSCCC色谱包括色谱包括储液罐储液罐、泵泵、螺旋管分离螺旋管分离柱柱、检测器检测器、色谱工作站色谱工作站或或数据采集软件数据采集软件或记或记录仪以及录仪以及馏分收集器馏分收集器等部分。等部分。选择溶剂体系选择溶剂体系平衡平衡选择固定相选择固定相充满螺旋管柱充满螺旋管柱高速旋转螺旋管高速旋转螺旋管泵入泵入流动相流动相流动相流出，注入待分离的样品流动相流出，注入待分离的样品收集馏分收集馏分分分离离效效果果溶剂系统溶剂系统固定相固定相流动相流动相洗脱方式、流动相的流速洗脱方式、流动相的流速仪器的旋转方向和转速仪器的旋转方向和转速样品浓度和进样方式样品浓度和进样方式柱温等柱温等检测器检测器紫外紫外-可见光检测器可见光检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器质谱检测器等质谱检测器等与其它色谱分离技术相比，高速逆流色谱具有与其它色谱分离技术相比，高速逆流色谱具有如下特点：如下特点：分离效率高分离效率高制备量大制备量大操作灵活操作灵活回收率高回收率高应用范围广应用范围广分离成本低分离成本低三、溶剂体系的要求三、溶剂体系的要求1 1 溶剂体系的种类溶剂体系的种类弱极性溶剂体系弱极性溶剂体系中等极性溶剂体系中等极性溶剂体系强极性溶剂体系强极性溶剂体系两相两相由由正己烷和水正己烷和水组成，可用组成，可用甲醇、乙醇、醋酸甲醇、乙醇、醋酸乙酯乙酯等来调节溶剂系统的极性。等来调节溶剂系统的极性。典型的溶剂体系典型的溶剂体系有：有：正己烷正己烷-醋酸乙酯醋酸乙酯-乙醇乙醇-水水 正己烷正己烷-醋酸乙酯醋酸乙酯-甲醇甲醇-水水中等极性溶剂体系的中等极性溶剂体系的两相两相由由氯仿和水氯仿和水组成，可以加入组成，可以加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯甲醇、乙醇、醋酸乙酯等来调节溶剂系统的极性。等来调节溶剂系统的极性。适合于适合于黄酮类、蒽醌类、香豆素黄酮类、蒽醌类、香豆素和一些极性较大的和一些极性较大的木木脂素和萜类脂素和萜类的分离。的分离。典型的溶剂体系是典型的溶剂体系是氯仿氯仿-甲醇甲醇-水水（4 4：3 3：2 2）强极性溶剂体系的强极性溶剂体系的两相两相基本物质是基本物质是正丁醇和水正丁醇和水，可以，可以加入加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯甲醇、乙醇、醋酸乙酯等溶剂来调节溶剂系统的等溶剂来调节溶剂系统的极性，也可以在氯仿水体系中调节极性，也可以在氯仿水体系中调节pHpH值值来增大极性来增大极性,或或在异丁基甲醚水体系中加入在异丁基甲醚水体系中加入适量的酸和碱适量的酸和碱.适合于极性适合于极性很强的生物碱类化合物的分离。很强的生物碱类化合物的分离。典型的溶剂体系典型的溶剂体系:氯仿氯仿-甲醇甲醇-HCl-HCl异丁基甲醚异丁基甲醚-水水（有机相加三乙胺，水相加盐酸）（有机相加三乙胺，水相加盐酸）2 2 溶剂体系选择的步骤溶剂体系选择的步骤（1 1）预测要分离物质的极性，粗选一个溶剂体系）预测要分离物质的极性，粗选一个溶剂体系；（2 2）取少量样品于上下相）取少量样品于上下相各各2 2毫升毫升的溶剂体系中，用的溶剂体系中，用TLCTLC进行检验，可加入进行检验，可加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯甲醇、乙醇、醋酸乙酯等来调节等来调节溶剂体系的极性，直到样品在上下相中的分配比溶剂体系的极性，直到样品在上下相中的分配比K K为为0.52为止；为止；（3 3）用）用HPLCHPLC测定测定K K值；值；（4 4）用）用分析型分析型HSCCCHSCCC进行预分离，再用进行预分离，再用制备型高速逆制备型高速逆流色谱流色谱进行分离。进行分离。（1 1）溶剂不造成样品的分解或变性溶剂不造成样品的分解或变性；（2 2）样品在溶剂中有足够高的溶解度样品在溶剂中有足够高的溶解度；（3 3）样品在溶剂系统中有合适的分配系数样品在溶剂系统中有合适的分配系数 值值；（固定相为管柱总体积的（固定相为管柱总体积的50%50%以上，分配系以上，分配系 数为数为0.52）（4 4）固定相能实现足够高的保留固定相能实现足够高的保留。3 3 选择溶剂时应注意选择溶剂时应注意生物碱生物碱氯仿氯仿-甲醇甲醇-NaH-NaH2 2POPO4 4溶液溶液(pH=4)(pH=4)溶剂体系溶剂体系氯仿氯仿-甲醇甲醇-盐酸体系盐酸体系异丁基甲醚异丁基甲醚-四氢呋喃四氢呋喃-水体系水体系异丁基甲醚异丁基甲醚-水体系水体系正己烷正己烷-乙醇乙醇-水体系水体系正己烷正己烷-醋酸乙酯醋酸乙酯-水水正己烷正己烷-醋酸乙酯醋酸乙酯-甲醇甲醇-水水4 4 不同物质的溶剂体系不同物质的溶剂体系黄黄酮酮类类化化合合物物正己烷正己烷-醋酸乙酯醋酸乙酯-甲醇甲醇-水水正丁醇正丁醇-醋酸乙酯醋酸乙酯-水水氯仿氯仿-甲醇甲醇-水水正己烷正己烷-醋酸乙酯醋酸乙酯-正丁醇正丁醇-甲醇甲醇-醋酸醋酸-水水正己烷正己烷-醋酸乙酯醋酸乙酯-甲醇甲醇-水水萜类萜类异辛烷异辛烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水异辛烷异辛烷-甲醇甲醇-水水氯仿氯仿-甲醇甲醇-水水木脂素和香豆素木脂素和香豆素氯仿氯仿-甲醇甲醇-水水正己烷正己烷-乙睛乙睛-醋酸乙酯醋酸乙酯-水水正己烷正己烷-甲醇甲醇-水水氯仿氯仿-甲醇甲醇-水水四、应用四、应用溶剂系统溶剂系统两相溶剂系统：两相溶剂系统：正己烷正己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-乙醇乙醇-水水（6 6：3 3：2 2：5 5），在），在分液漏斗分液漏斗中充分混合，临用前将其分开。中充分混合，临用前将其分开。分离条件：分离条件：室温下，室温下，上相为固定相上相为固定相，下相为流动相下相为流动相，流速为，流速为0.7ml/min0.7ml/min；洗脱方式：洗脱方式：由首端向尾端洗脱由首端向尾端洗脱；主机：主机：正转正转，流速为，流速为800r/min800r/min进样进样:3.8mg/2ml3.8mg/2ml；检测：紫外检测器，波长为检测：紫外检测器，波长为220nm220nm实验结束时实验结束时,用用N N2 2将将固定相固定相由由首端向尾端首端向尾端推出推出,分分别收集别收集四四份份,色谱柱管用色谱柱管用甲醇清洗甲醇清洗两次两次.
