连接产物的转化.ppt

连接产物的转化1、puc19质粒用HindIII和EcoRI酶切，线性化；2、目的片段用HindIII和EcoRI酶切，线性化；3、回收酶切后的质粒和目的片段，定量,连接；一 实验目的 掌握细菌转化的一般技术和原理。二 实验原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。使受体细菌从周围介质中吸收外来DNA分子，从而获得新的遗传物质的过程就是转化。通常所用的受体是大肠杆菌。用于转化的细菌被称为感受态细胞。所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5x1062x107 转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆实验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高1001000倍。大肠杆菌的转化常用热激法，该法最先是由大肠杆菌的转化常用热激法，该法最先是由Cohen于于1972年发现的。其原理是细菌处于年发现的。其原理是细菌处于0，CaCl2的低渗溶的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗形成抗DNase的羟基的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短短时间热冲击处理，促使细胞吸收时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。平板上，可选出所需的转化子。除热击法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不除热击法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到进入细菌，转化率最高能达到1091010转化子转化子/ug闭闭环环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。因操作简便，愈来愈为人们所接受。DNA分子转化分以下几步分子转化分以下几步:1.吸附双链DNA分子吸附于受体菌表面；2.转入双链DNA分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解；3.自稳外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链；4.表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译重组子的筛选重组子的筛选 抗生素标记法：抗生素标记法：菌株为某种抗生缺陷型，菌株为某种抗生缺陷型，而质粒上带有该抗性基因而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素，（如氨苄青霉素，卡那霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素卡那霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。的培养基上长出。互补法：互补法：现在使用的许多载体（如现在使用的许多载体（如PUC系列）有含有一个大肠杆菌系列）有含有一个大肠杆菌的短区段，其中含有的短区段，其中含有半乳糖苷酸基因（半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列）的调控序列和头和头146个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。受体菌则含编码受体菌则含编码半乳糖苷酶端半乳糖苷酶端aa的序列。的序列。半乳糖苷酶表达，半乳糖苷酶表达，在底物在底物5溴溴4氯氯3吲哚吲哚D半乳糖苷（半乳糖苷（x-gal）培养基）培养基中形成兰色菌落。中形成兰色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同而区分重组子和非重组通过颜色不同而区分重组子和非重组子。子。实验步骤：1）将）将2l连接产物与连接产物与100l感受态细胞在冰上混匀，并静置感受态细胞在冰上混匀，并静置30min，42下处理下处理60sec，然后加入，然后加入600l的的LB（A-）液体）液体培养基，在摇床上培养基，在摇床上37摇动培养摇动培养1hr。（2）(在在LB（A+）平板上涂布）平板上涂布40l的的X-gal和和4lIPTG溶液溶液)待完全吸收后，将转化产物离心后悬浮，涂平板。待完全吸收后，将转化产物离心后悬浮，涂平板。37过夜过夜培养。培养。