酵母双杂交自激活.ppt
酵母双杂交(自激活)真核生物的转录因子是由两个可以分开的、真核生物的转录因子是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域功能上相互独立的结构域(domain)组成的。组成的。一、原理一、原理酵母的转录激活因子酵母的转录激活因子GAL4，在，在N端有一个端有一个由由147个氨基酸组成的个氨基酸组成的DNA结合域结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由端有一个由113个个氨基酸组成的氨基酸组成的转录激活域转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的分子的BD可以同上游激活序列可以同上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)结合。结合。AD则能激活则能激活UAS下游的基因进行转录。下游的基因进行转录。单独的单独的BD和和AD都不能激活都不能激活UAS的下游的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活功能。在一起才具有完整的转录激活功能。Regulation of gene expression in yeastgeneUAS(upstream activation sequence)transcription activatorDNA binding domainactivation domaintranscription machineryYeast two-hybrid system:a genetic assay for detecting protein-protein interactionsYeast two-hybrid system:a genetic assay for detecting protein-protein interactionsXYSuppose we have two proteins.One way of answering this question is touse the yeast two hybrid method.and the question,do these two protein bind each other?XYRegulation of gene expression in yeastgeneUAS(upstream activation sequence)transcription activatorDNA binding domainactivation domaintranscription machineryreporter geneXYXYXYdo we get expression of the reporter?yes,we have expression ofthe reporter indicating thatthe proteins bind!Do theseproteinsbind?our two hybridproteins bind!thus forming a functionaltranscription activator.Yeast two-hybrid system:a genetic assay for detecting protein-protein interactionsHis,-gal 一般情况下，单独的一般情况下，单独的 BD 可以与可以与 GAL4 上游活化序列（上游活化序列（GAL UAS）结合，但不能）结合，但不能引起转录。然而，将一段引起转录。然而，将一段具有转录激活活性具有转录激活活性的转录因子基因构建到的转录因子基因构建到BD载体上，若其表载体上，若其表达产生的达产生的 BD 单独与单独与 UAS 结合也可以引起结合也可以引起下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双杂中的杂中的自激活现象自激活现象。反过来，可以利用这种。反过来，可以利用这种自激活现象来验证某个转录因子是否具有转自激活现象来验证某个转录因子是否具有转录激活活性。录激活活性。XXreporter geneHis,-gal自激活原理Transcription factorsGAL4BDYPDA液体液体 500ml固体固体 100ml蛋白胨10g2g酵母提取物5g1g琼脂2g0.2%ade10ml2ml葡萄糖10g2gYPDA培养基培养基0.2g ade定容至 100ml 0.2%的ade母液pH 6.5 灭菌灭菌 121 15min正对照：正对照：pGAL4负对照：负对照：pBD-GAL41.将将-70下冻存的酵母菌在下冻存的酵母菌在YPAD平板上划线，倒置于平板上划线，倒置于30培养培养2-3天。天。2.挑取挑取2-4个大菌落（直径个大菌落（直径2-3mm）于）于1.5ml YPAD液体培养基中，剧烈震液体培养基中，剧烈震荡荡5min，打散菌落打散菌落，接种于，接种于50ml YPAD液体培养基中（液体培养基中（250ml三角瓶），三角瓶），230-250转转/min，30培养培养18-24hr。3.取菌液测定其取菌液测定其OD600值，值，需达到需达到1.5。若不到，再培养。若不到，再培养12hr，若还不到，若还不到，换单克隆重摇。换单克隆重摇。4.取取50ml菌液于菌液于300mlYPAD培养基中（培养基中（1-2L大三角瓶），大三角瓶），30，230rpm，摇培，摇培3hr，至，至 OD600值为值为0.40.6。5.4000rpm 5min 于常温收集菌体，重复一次。于常温收集菌体，重复一次。6.室温下室温下1000g离心离心5min，去上清，加入，去上清，加入50ml 超纯水清洗悬浮超纯水清洗悬浮3次。次。7.1000g离心离心5min，弃上清，用新配的，弃上清，用新配的1.5ml 1TE/LiAc重悬细胞，置冰重悬细胞，置冰上，即成为酵母感受态细胞。上，即成为酵母感受态细胞。（只能（只能现做现用现做现用，不能贮存，室温只能放置，不能贮存，室温只能放置1-2hr）。）。酵母菌株感受态细胞制备：酵母菌株感受态细胞制备：酵母转化酵母转化1.鲑鱼精鲑鱼精 DNA（20g/l）沸水中煮）沸水中煮20min，冰上冷却，冰上冷却10min。2.加入加入100l酵母感受态细胞、酵母感受态细胞、12l构建质粒（构建质粒（约约200ng）、）、100g鲑鲑鱼精、鱼精、600l TE-LiAc-PEG，变速涡旋，变速涡旋10s1min至混匀至混匀。3.30，200rpm/min，恒温摇床振荡，恒温摇床振荡30min。4.加入加入70l DMSO，温和温和颠倒混匀。颠倒混匀。5.42水浴热休克水浴热休克15min，后冰浴，后冰浴10min。6.常温下，常温下，3000rpm离心离心10s；弃上清（；弃上清（去干净去干净），用），用0.5ml 1TE重悬重悬细胞。（细胞。（1TE室温只能放置室温只能放置12hr）7.将转化后的酵母培养于将转化后的酵母培养于SD/-Trp培养基上，培养基上，30倒置培养约倒置培养约3-5天，直天，直至出现菌落。至出现菌落。阳性克隆的筛选：阳性克隆的筛选：将在将在SD/-Trp培养基上长出的酵母菌落转移到培养基上长出的酵母菌落转移到SD/-His培培养基上进行筛选。养基上进行筛选。30培养培养2天，检查生长情况。天，检查生长情况。对生长状态较好的单克隆进行对生长状态较好的单克隆进行-半乳糖苷酶活性分析。半乳糖苷酶活性分析。-半乳糖苷酶活性分析半乳糖苷酶活性分析（酵母克隆滤纸显色分析）1.取取2ml的的Z缓冲液缓冲液/X-gal溶液润透溶液润透2张滤纸；张滤纸；2.小心取一张滤纸覆盖于生长有转化子的平皿上，用涂布棒小心赶出气小心取一张滤纸覆盖于生长有转化子的平皿上，用涂布棒小心赶出气泡，使滤纸尽可能与酵母菌接触（泡，使滤纸尽可能与酵母菌接触（1min）；）；3.用一根针在滤纸上刺个小孔以标记菌落位置，用镊子轻轻取出滤纸，用一根针在滤纸上刺个小孔以标记菌落位置，用镊子轻轻取出滤纸，沾有菌的面朝上置液氮中沾有菌的面朝上置液氮中10s，夹出滤纸，室温解冻；重复，夹出滤纸，室温解冻；重复3次；次；4.沾有菌的面朝上，紧贴于预先用沾有菌的面朝上，紧贴于预先用Z缓冲液缓冲液/X-gal溶液润透过的那张滤纸溶液润透过的那张滤纸上，同时吸掉多余的上，同时吸掉多余的Z缓冲液缓冲液/X-gal溶液；溶液；5.沾有菌的面朝上，纸间不要有气泡，放置于沾有菌的面朝上，纸间不要有气泡，放置于30温箱温箱3-8h，观察酵母，观察酵母的颜色变化。的颜色变化。
