酶蛋白的结构.ppt

第三章第三章 酶蛋白的结构酶蛋白的结构 v蛋白质的一级结构（蛋白质的一级结构（primary structure）v蛋白质的二级结构（蛋白质的二级结构（secondary structure）v蛋白质的三级结构（蛋白质的三级结构（tertiary structure）v蛋白质的四级结构（蛋白质的四级结构（quaternary structure）蛋白质结构和功能的关系蛋白质结构和功能的关系v举例：举例：镰刀状细胞贫血病镰刀状细胞贫血病 v镰刀状细胞贫血病是最早被认识的一种分子病，流行于非洲的镰刀状细胞贫血病是最早被认识的一种分子病，流行于非洲的一些地区，患者的红细胞形态异常，有很多呈新月状或镰刀状，一些地区，患者的红细胞形态异常，有很多呈新月状或镰刀状，在红细胞脱氧时镰刀状细胞数量增加，严重时导致红细胞破裂、在红细胞脱氧时镰刀状细胞数量增加，严重时导致红细胞破裂、溶血而致命。溶血而致命。v镰刀状红细胞产生的原因是患者的血红蛋白异常。血红蛋白是镰刀状红细胞产生的原因是患者的血红蛋白异常。血红蛋白是红细胞内起携带氧气功能的一种重要的蛋白质，是一种四聚体红细胞内起携带氧气功能的一种重要的蛋白质，是一种四聚体蛋白质，由两个蛋白质，由两个亚基和两个亚基和两个亚基组成（亚基组成（22），其中），其中亚基亚基包含包含141个氨基酸残基，个氨基酸残基，亚基包含亚基包含146个氨基酸残基。镰刀状个氨基酸残基。镰刀状细胞贫血病患者由于基因突变，其血红蛋白（细胞贫血病患者由于基因突变，其血红蛋白（HbS）的）的亚基亚基N-末端第末端第6号位的氨基酸由原来正常血红蛋白（号位的氨基酸由原来正常血红蛋白（HbA）的高度）的高度极性的极性的Glu变成了非极性的变成了非极性的Valv这种改变导致血红蛋白表面电荷减少，在脱氧状态下溶解度下这种改变导致血红蛋白表面电荷减少，在脱氧状态下溶解度下降，发生不正常聚集，形成镰刀状红细胞，严重时造成红细胞降，发生不正常聚集，形成镰刀状红细胞，严重时造成红细胞破裂。血红蛋白分子共有破裂。血红蛋白分子共有574个氨基酸残基组成，仅仅两个个氨基酸残基组成，仅仅两个亚亚基上各改变了一个氨基酸残基，生理功能就发生了如此大的变基上各改变了一个氨基酸残基，生理功能就发生了如此大的变化，可见蛋白质的一级结构对功能的影响之大。化，可见蛋白质的一级结构对功能的影响之大。v牛胰核糖核酸酶复性实验牛胰核糖核酸酶复性实验v8个个CysSH形成形成4个二硫键的组合方式有个二硫键的组合方式有753=105种，因而重新形成正确配对的概率仅种，因而重新形成正确配对的概率仅1/105，第一节第一节 蛋白质一级结构研究方法蛋白质一级结构研究方法 v1.蛋白质的分离纯化和相对分子质量的测定蛋白质的分离纯化和相对分子质量的测定v2.2.确定蛋白质分子中多肽链的数目确定蛋白质分子中多肽链的数目v3.拆分并分离蛋白质分子的多肽链拆分并分离蛋白质分子的多肽链v4.测定每条多肽链的氨基酸组成测定每条多肽链的氨基酸组成v5.多肽链的多肽链的N-末端和末端和C-末端分析末端分析v6.6.多肽链的局部断裂和肽段的分离多肽链的局部断裂和肽段的分离 v7.测定各个肽段的氨基酸顺序测定各个肽段的氨基酸顺序v8.8.确定肽段在多肽链中的次序从而排列出多肽链的氨基酸顺序确定肽段在多肽链中的次序从而排列出多肽链的氨基酸顺序 v9.多肽链中二硫键位置的确定多肽链中二硫键位置的确定v1.蛋白质的分离纯化和相对分子质量的测定蛋白质的分离纯化和相对分子质量的测定v电泳单一带电泳单一带vSDS-PAGE测分子量（质谱法）测分子量（质谱法）v2.2.确定蛋白质分子中多肽链的数目确定蛋白质分子中多肽链的数目v末端分析法末端分析法3.拆分并分离蛋白质分子的多肽链拆分并分离蛋白质分子的多肽链v氧化法氧化法v氧化法的优点在于二硫键一旦拆开，氧化法的优点在于二硫键一旦拆开，不会重新形成连接，但在氧化过程中不会重新形成连接，但在氧化过程中伴随着一些副反应，伴随着一些副反应，Met侧链被氧化侧链被氧化生成亚砜，生成亚砜，Trp侧链被破坏。侧链被破坏。v还原法还原法v为了防止游离巯基重新氧化，还需加为了防止游离巯基重新氧化，还需加入烷化剂如碘乙酸，使巯基上发生取入烷化剂如碘乙酸，使巯基上发生取代反应而不会重新被氧化代反应而不会重新被氧化 4.测定每条多肽链的氨基酸组成测定每条多肽链的氨基酸组成v蛋白质完全水解：要求完全水解且不破坏氨基酸蛋白质完全水解：要求完全水解且不破坏氨基酸v1）酸水解：）酸水解：v v作水解程度时间图确定最佳时间作水解程度时间图确定最佳时间v1-10mg蛋白样品蛋白样品 加加HCl 抽真空抽真空 封闭封闭 烘箱烘箱v特点：特点：a）Trp完全破坏，生成不溶性物质完全破坏，生成不溶性物质vb）Ser、Thr、Tyr部分破坏，部分破坏，Ser破坏破坏10-15%，Thr、Tyr破破坏坏5-10%，应予以校正，应予以校正vc）Asn Asp Glu Gln vd）胱氨酸胱氨酸半胱氨酸半胱氨酸ve）大部分氨基酸不破坏大部分氨基酸不破坏v2）碱水解：）碱水解：v特点：特点：a)Trp不破坏不破坏 b）大部分氨基酸破坏）大部分氨基酸破坏v分离检测：分离检测：1）纸层；）纸层；2）薄层；）薄层；3）离交；）离交；4）氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪5.多肽链的多肽链的N-末端和末端和C-末端分析末端分析v目的：有几条肽链；目的：有几条肽链；N N、C C末端是何氨基酸末端是何氨基酸 v测不出末端的几种原因：蛋白质分子为环肽；末端被测不出末端的几种原因：蛋白质分子为环肽；末端被保护试剂保护；末端是保护试剂保护；末端是Prov5-1 N端测定（介绍原理、分离检测方法和优缺点）端测定（介绍原理、分离检测方法和优缺点）v1）FDNB法（法（Sanger法；法；2.4-二硝基氟苯法）二硝基氟苯法）va）原理：）原理：vb)分离检测：乙醚萃取，分离检测：乙醚萃取，DNP-Aa溶于乙醚而溶于乙醚而Aa不溶不溶v标准标准Aa+DNP反应反应纸层纸层喷茚三酮喷茚三酮v未知未知DNP-Aa-纸层纸层喷茚三酮喷茚三酮v比较即得结果，若结果是两点以上则证明是有比较即得结果，若结果是两点以上则证明是有几条肽链组成几条肽链组成vc）优点：反应条件温和，末端产物易分离）优点：反应条件温和，末端产物易分离v 缺点：缺点：N端是端是Pro测不出；不能进行测不出；不能进行N端测序端测序 vLys的另一氨基生成的另一氨基生成e-e-DNP-Lys，由于它不溶于，由于它不溶于乙醚故不影响测定结果乙醚故不影响测定结果v2)2)丹磺酰氯法（丹磺酰氯法（DNS法）法）va)原理：vb）分离检测：）分离检测：DNS-Aa溶于乙酸乙酯，溶于乙酸乙酯，Aa不溶不溶v标准标准Aa+DNS反应反应纸层纸层荧光显色荧光显色v未知未知DNS-Aa-纸层纸层荧光显色荧光显色v比较即得结果，若结果是两点以上则证明是有几比较即得结果，若结果是两点以上则证明是有几条肽链组成条肽链组成vc）优点：灵敏度高；是前种方法的）优点：灵敏度高；是前种方法的100倍；用量少，倍；用量少，样品量为样品量为0.1-2ngv 缺点：缺点：DNS-Pro、DNS-Try被破坏；被破坏；N端是端是Pro、Try测不出；不能进行测不出；不能进行N端测序端测序 v3)Edman3)Edman降解法降解法 苯异硫氰酸酯法（苯异硫氰酸酯法（PITC法法)va)a)原理：原理：v a）分离检测：）分离检测：PTH-Aa溶于乙酸乙酯、丁酸乙酯，溶于乙酸乙酯、丁酸乙酯，Aa不溶不溶vc）优点：）优点：N端是端是Pro可测；能进行可测；能进行N端测序端测序 v 缺点：灵敏度稍差缺点：灵敏度稍差 v4）DansyCl-Edman法法v既可检测既可检测N端序列又有较高灵敏度端序列又有较高灵敏度 v5)5)亮氨酸氨肽酶法亮氨酸氨肽酶法 v此酶专一水解此酶专一水解N端羧基形成的肽键，可测端羧基形成的肽键，可测N端序端序列，但不能测列，但不能测N端为端为Pro.v5-2 C-末端分析末端分析 vC-末端分析方法也有很多，但至今还不能令人末端分析方法也有很多，但至今还不能令人满意，常用的有肼解法、还原法、羧肽酶法等。满意，常用的有肼解法、还原法、羧肽酶法等。v1）肼解法）肼解法v原理：原理：vb）分离检测：）分离检测：v苯甲醛苯甲醛+酰肼酰肼沉淀沉淀离心离心v上清液中含游离基酸上清液中含游离基酸 v2)还原法还原法v用还原剂如硼氢化锂处理肽链，则用还原剂如硼氢化锂处理肽链，则C-末端残基末端残基的的-羧基被还原成醇，将肽链完全水解后，分羧基被还原成醇，将肽链完全水解后，分析水解产物，其中的析水解产物，其中的-氨基醇对应的即为氨基醇对应的即为C-末末端氨基酸。端氨基酸。v3)羧肽酶法羧肽酶法v羧肽酶是一种专一从多肽链的羧肽酶是一种专一从多肽链的C-末端开始逐个水解氨基酸残基末端开始逐个水解氨基酸残基的蛋白水解酶。由于该酶的专一性，当它作用于多肽链时，的蛋白水解酶。由于该酶的专一性，当它作用于多肽链时，C-末端残基首先被水解下来，然后是末端残基首先被水解下来，然后是C-末端第二个氨基酸残基，末端第二个氨基酸残基，依此类推。根据氨基酸释放的动力学曲线，可以确定依此类推。根据氨基酸释放的动力学曲线，可以确定C-末端氨末端氨基酸以及靠近基酸以及靠近C-末端的几个氨基酸的排列顺序。不过这是理想末端的几个氨基酸的排列顺序。不过这是理想的情况，实际测定中常常有多种因素干扰，很难确定的情况，实际测定中常常有多种因素干扰，很难确定C-末端多末端多个氨基酸的排列顺序。个氨基酸的排列顺序。v羧肽酶羧肽酶A：a）Lys、His、Arg在在C-末端不能水解末端不能水解v b）C-末端是末端是Pro不能水解不能水解vc）C-末端第二个是末端第二个是Pro，无论第一个是何氨基酸都不能水解，无论第一个是何氨基酸都不能水解v羧肽酶羧肽酶B：a）水解）水解C-末端为末端为Lys、His、Arg的的vb）C-末端第二个是末端第二个是Pro，无论第一个是何氨基酸都不能水解，无论第一个是何氨基酸都不能水解v6.6.多肽链的局部断裂和肽段的分离多肽链的局部断裂和肽段的分离v在氨基酸顺序测定时，只要从肽链某一末端（通常是在氨基酸顺序测定时，只要从肽链某一末端（通常是N-末端）末端）起逐个将氨基酸残基断裂下来，并对游离出来的氨基酸或其起逐个将氨基酸残基断裂下来，并对游离出来的氨基酸或其衍生物进行鉴定，就可以确定氨基酸序列。但是实际操作时，衍生物进行鉴定，就可以确定氨基酸序列。但是实际操作时，由于每次末端氨基酸残基发生断裂的效率不能达到由于每次末端氨基酸残基发生断裂的效率不能达到100%，或者说，在大多数肽段在断裂第二个氨基酸残基时，少数肽或者说，在大多数肽段在断裂第二个氨基酸残基时，少数肽段可能因为上一轮未发生反应而正在断裂第一个氨基酸残基，段可能因为上一轮未发生反应而正在断裂第一个氨基酸残基，这样势必给测定带来干扰。如果肽链很短，这样的干扰不会这样势必给测定带来干扰。如果肽链很短，这样的干扰不会对测定产生重大影响；但蛋白质肽链的长度都超出这一范围，对测定产生重大影响；但蛋白质肽链的长度都超出这一范围，这样测定将无法进行下去。所以人们这样测定将无法进行下去。所以人们首先需将肽链进行适当首先需将肽链进行适当的分解，将其断裂成若干长度合适的肽段，再分别测定这些的分解，将其断裂成若干长度合适的肽段，再分别测定这些肽段的氨基酸顺序。肽段的氨基酸顺序。1 1溴化氰裂解法：溴化氰裂解法：vBrCNBrCN：专一水解：专一水解MetMet羧基形成的键羧基形成的键v优点：专一性强，切点少，产率高（优点：专一性强，切点少，产率高（85%85%）v*弱酸、弱碱也可使肽链水解但专一性不好弱酸、弱碱也可使肽链水解但专一性不好2 2酶解法：酶解法：v胰酶：水解碱性氨基酸羧基所形成的键（胰酶：水解碱性氨基酸羧基所形成的键（LysLys，ArgArg）v*碱性氨基酸的羧基连接的是碱性