重组门冬酰胺酶制备表达纯化.ppt
酶的分类酶的分类酶单纯蛋白质（多种氨基酸组成）结合蛋白质酶蛋白（蛋白部分）辅酶或辅基（非蛋白部分）金属：如Cu2、Mn2金属有机物：如铁朴啉不含金属的有机物如：烟酰胺、VB2等的衍生物酶胞外酶胞内酶游离酶结合酶门冬酰胺酶门冬酰胺酶 L-天门冬酰胺酶 AnsB 能催化天门冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨。淋巴瘤和白血病细胞通常不能合成天门冬酸胺，L-天门冬酸胺酶将阻止癌细胞蛋白质合成而导致癌细胞死亡。在临床上，L-天门冬酰胺酶已广泛用于治疗白血病和淋巴瘤。但目前国内尚不能生产，国外也仅有低产酶能力的大肠杆菌野生株产品，生产成本高，药价昂贵。基因工程菌产品既能填补国内空白，又能大幅度降低生产成本。参考文献1-重组与表达 刘景晶，李晶，吴梧桐，胡梅清.大肠杆菌L-天门冬酰胺酶基因的高效表达 中国药科大学生物化学教研室,南京210009南京铁道医学院生物化学教研室,南京2100092-提取与纯化刘景晶,金健勤,戴海滨,吴梧桐.大肠杆菌L门冬酸胺酶的提取和纯化中国药科大学生化教研室,南京210009重组与表达材料材料 限制酶 Ncol、Hind III及T 4 DNA 连接酶，购自 Promega 公司；Taq 酶、dNTP、IPTG 购自华美公司；丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、SDS购自sigma 公司。pKK 233-2 购自clonetech 公司；pKK 233-ansB 是将代PCR 扩增得到的AnsB 基因DNA 用 Ncol 和Hind III消化后，定向插入pKK 233-2 的多克隆位点而得到的重组质粒。实验方法 PCR扩增扩增AnsB基因基因重组质粒重组质粒PKK233-ansB 的构建的构建 阳性转化子的筛选阳性转化子的筛选 PCR扩增扩增AnsB基因基因 模板的制备：用接种环挑取CPU 210009菌体少许，在裂解液(1TritonX-100,2mmol/LTris-HCl pH8.5,2mmol/L EDTA)1ml中振散，95C加热处理液10min,吸取处理液5ul用于PCR。引物：E1:5-GGCCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCACITGC 一3 E2:5-GGAAGCTTGAGAATGCCGTGATAC 一3 11：5-GGCCATGGAGT111TCAAAAAGACGCACTTGC一3 12:5-GGAAGCTTAGACTGATTGAAGATCTGCTGG 一3 扩增条件：84C变性1 min;60C复性2 min;72C延伸1 min；循环28次。重组质粒重组质粒PKK233-ansB 的构建的构建 PcR 扩增后的DNA片段及质粒pKK 233-2 同时分别用限制酶Ncol 和Hindl 消化并用琼脂搪凝胶电泳分离和回收质粒大片段；将消化后的DNA 片段和电泳回收的质粒大片段用T 4.DNA 连接酶连接，连接产物经琼脂糖凝胶电泳回收后转化HB 1 01、71/15、ATCc 9637、JM107、cPU 210009，筛选获得相应的阳性转化子。阳性转化子的筛选阳性转化子的筛选 将涂布在含氨节青霉素的LB 平板上生长出的单菌落用牙签逐个挑入方格化的新鲜LB 平板上，为每个克隆编号。平板置37C 温箱中过夜，待菌落形成后，用灭菌牙签逐个挑取少量菌体，移入预先加有0.1 mol/L 硼酸缓冲液（pH 8.4)50ul的酶标板反应孔内，待菌体分散后，每孔各加入0.04 mol/L 天门冬酞胺底物溶液50 ul,37C 保温15 min，加奈氏试剂50 ul，呈深棕红色孔内对应的单菌落即为阳性转化子。条件选择条件选择酶的纯度酶的纯度酶的浓度酶的浓度金属离子金属离子pH温度、时间温度、时间晶种晶种 酶的分离纯化工作中的注意事项酶的分离纯化工作中的注意事项1.1.防止酶蛋白变性防止酶蛋白变性2.2.防止复因子丢失防止复因子丢失3.3.防止酶被蛋白防止酶被蛋白 水解酶降解水解酶降解提取纯化蔗糖溶液提取法蔗糖溶液提取法 L-天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析）天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析）酶活力的测定酶活力的测定酶分子量测定酶分子量测定 提取纯化 L-天门冬酰胺的提取（蔗天门冬酰胺的提取（蔗糖溶液提取法）糖溶液提取法）向菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖抽提液（蔗糖40，溶菌酶200mg/L,EDTA 10mmol/L,pH7.5.）在30C震2小时，8000r/min离心30min,收集上清酶液。L-天冬氨酸酶的纯化天冬氨酸酶的纯化蔗糖溶液提取法获得的酶液,加入硫酸铵至55饱和度，调pH至7.0,室温搅拌1小时,离心除去沉淀。上清液中加入硫酸铵到90饱和度，离心收集沉淀。沉淀物用50mmol/L、pH7.0磷酸缓冲液溶解并透析。透析后的酶液通过预先用10mmol/L、pH7.6的磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素DE52层析柱（1.030cm）。用30mmol/L磷酸缓冲液洗脱,流速为40ml/h。每分钟收集一定的洗脱液并于280处测定紫外吸收值，绘制洗脱曲线（如图如图1）Ph4.8,通过预先用50mmol/L,pH4.9磷酸缓冲液平衡的CM-纤维素 层析柱（1.08.0cm）,用50mmol/L、pH5.2 磷酸缓冲液洗脱,收集显示天门冬酞胺酶活力的组分,冻干后得天门冬酰胺冻干粉。再进行称量计算产量。L-天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析）天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析）取适量样品加入1%NH4HCO3溶解至1.0 mg/ml，按1 30(W/W)加入胰蛋白酶，370.5保温16 h，50%冰醋酸终止反应备用。色谱条件流动相：A为0.1%TFA 水，B为0.1%TFA，乙腈 水(80 20)。梯度：060 min，B：030%；60120 min，B：30%38%；120175，B：38%80%。流速：0.2 ml/min；上样量：自动进样50 l；检测波长：210 nm。酶活力的测定酶活力的测定取004mol/L L-天门冬酰胺1 ml,0.1 mol/L pH8.4硼酸一硼酸钠缓冲液lml，取酶液0.2ml于试管中，于37C水浴保温10min，加15三氯乙酸0.5ml终止反应，经4000r/min离心，取上清液1ml,奈氏试剂2 ml和蒸馏水7 ml，放置15 min后于500nm波长比色测定生成的氨。在上述条件下，每分钟催化L一天门冬酰胺水解释放1umol氨所需的酶量定义为一个酶活力单位U。1.3.7酶分子量测定酶分子量测定SDS-PAGE
