霍奇金淋巴瘤实验设计.ppt
霍奇金淋巴瘤中IB基因突变的研究 研究背景霍奇金淋巴瘤霍奇金淋巴瘤（Hodgkins lymphoma，HL，Hodgkins disease，）是，）是恶性淋巴恶性淋巴瘤瘤的一个独特类型。的一个独特类型。研究背景 其特点为：临床上病变往往从一个或一组淋巴结开始，逐渐由邻近的淋巴结向远处扩散。原发于结外淋巴组织的少见。研究背景 瘤组织成分多样，但HL特异性的病理改变为大量反应性增生的背景淋巴细胞中可见少于1%Reed-Sternberg细胞（R-S细胞）。这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞(镜影细胞)研究背景 p53和bcl-2基因突变 EB病毒感染 但证据均不足，HL的发病机制尚未明确肿瘤细胞研究背景 有研究发现NF-B(RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。1 IB作为重要的NF-B通路抑制因子，在多种瘤细胞中表达量均减少。研究背景 将对IB激酶（IB kinase,IKK）无反应的IB突变体导入HRS细胞中可阻断NF-B的活化，导致细胞凋亡，说明IB在HL发病机制中有重要作用。2研究背景 Emmerich等人的研究表明HRS细胞中IB mRNA高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与HL中泛素化降解活性增强有关，也可能由IB蛋白结构改变导致。3研究目的 本实验意在：了解IB基因在HL中突变的情况；分析经典型HL HRS中IB突变的特点、可能造成的蛋白结构异常；以及这些异常的病理意义，即其与HL发病的相关性。实验材料与试剂 霍奇金淋巴瘤组织样本 CD30单抗（Dako公司，克隆号BerH2，效价1：20）Leica ASLMD激光显微系统 PCR引物（北京赛百胜公司）PCR仪（包括反应体系）DNA测序仪实验流程1.CD30免疫组化2.激光显微切割和DNA 提取3.IB基因扩增4.PCR产物检测5.待测基因外含子测序CD30免疫组化采用EnVision两步法。将冰冻组织切成6m厚连续切片，贴于Leica PEN膜空白切片上，用含005 NP40的丙酮(vv)固定10 min，室温下自然干燥；CD30免疫组化 6 H2O2-甲醇，37 10 min，消除内源性过氧化物酶；加1：20稀释的一抗；加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。激光显微切割和DNA 提取 用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）。将目的细胞从切片上分离，在光压强作用下被收集到离心管盖内，每例标本36组，每组约2570个细胞。切割周围的正常淋巴细胞每例2管，每管约50个细胞。扩增目的基因，上游引物：5-CACACTGTGCCCATCTACG-3，下游引物：5一GGTc1-ITIGCGGATGTCCAC一3。（缓冲体系：10X反应缓冲液25 l，MgCL2(25 mmolL)15 l，dNTP(10 mmoLL)10 l，上游引物(10 moL L)05 l，下游引物(10 molL)05 l，Taq酶(5 U L)03 l，模板20 l，总体积25 l。反应条件：94预变性5 min，94变性1 min，55退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72延伸7min，至4结束。以双蒸水代替DNA模板作为阴性对照。）IB基因扩增 对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IB 6个外显子进行半巢式PCR扩增。用已知IB外显子PCR扩增阳性的标本为模板作阳性对照，用双蒸水作为阴性对照。PCR扩增反应体系扩增扩增IB第一和第二外显子反应体系：第一和第二外显子反应体系：10 X PCR缓冲液50 1，MgC1：(25mmoiL)50 Ixl，dNTPs(10 mmol L)20 l，DMSO20 l，Taq DNA聚合酶(5 UpJ)10 l，DNA模板(05 gIL1)20 l，扩增第一外显子时加引物1 Ixl；扩增第二外显子时加引物03 l，补所需ddH2O使反应体系达到50 I。反应条件：预变性95，5min，继而95变性50 s，65退火30 s，72延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。第二轮，反应体系50 l，扩增第一和第二外显子时加引物125 l。扩增第一外显子时另加2 l DMSO(扩增第二外显子时不加DMSO)。反应条件同第一轮。扩增扩增IB第三到第六外显子反应体系第三到第六外显子反应体系：第一轮，l0PCR缓冲液50 Ixl，MgCL2(25 mmolL)40 l，dNTPs(10 mmolL)20 l，Taq DNA聚合酶(5 U L)10 l，DNA模板(05 g L)20 l，引物1 l。反应条件同扩增一、二外显子者，但退火温度为63。第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为125 L。反应条件为预变性95，5 min，继而95变性50 S，65退火30 S，72 oC延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。）PCR产物检测 取5 l PCR产物，用2琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。紫外灯下观察。IB的6个外显子阳性扩增产物大小分别为exon1(476bp)、exon2(433bp)、exon3(399bp)、exon4(184bp)、exon5(381bp)和 exon6(441bp)。预期结果电泳电泳条带不在同一水平线上基因明显突变。预期结果电泳电泳条带在同一水平线上。没有突变 点突变或分子量很小的碱基序列突变待测基因外含子测序 每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序。预期结果测序碱基序列出现改变图A-箭头处为T-A突变（TGA为终止密码）图B-反向测序证实（蓝色-C,红色-T，绿色-A，黑色-G）预期结果碱基序列没有突变 C、D分别为没有突变的正、反向测序预期结果 肿瘤细胞IB基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞IB基因没有突变。肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IB基因都没有突变。肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IB的突变率都增加IB基因参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化有关IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化估计不会发生这种情况，如若发生则需要进一步研究参考文献1 Bargou R.C,et al.Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkins disease tumor cells J.J Clin Invest,1997,100(12):2961-9.2 Dejardin E,et al.Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.Oncogene,1999,18(16):2567-77.3 Emmerich F,et al.Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells J.Blood,1999,94(9):3129-34.Thank you！巢式PCR 巢式聚合酶链反应巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction,nPCR)也称套式也称套式PCR。在这种技术中，首先用一对外引物进行第1轮PCR，然后再使用第1对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增，所以称为巢式PCR。为了经济节约，可在第2轮扩增时采用半巢式，半巢式，设计单条引物，另一条引物与第1轮扩增共用，。反向测序 一个是正向引物（上游引物），正向引物（上游引物），用它来测序就是正向测序(从上游往下测序)，也就是5到3 另外一个就是反向引物（下游引物反向引物（下游引物），用它来测序就是反向测序（从下游往上测序），也就是3到5 如果片段在800以内，那么随便进行一个方向就能测出你全部的序列了 如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）EnVision两步法DAKO EnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。
