高效液相色法.ppt

六、高效液相色谱法六、高效液相色谱法 高效液相色谱法：高效液相色谱法：以高压输出的液体以高压输出的液体为流动相的色谱技术。为流动相的色谱技术。High Performance Liquid ChromatographHPLC 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 1.高压：对流动相施加高压，使其迅速地通过色高压：对流动相施加高压，使其迅速地通过色谱柱液；谱柱液；2.高效：分离效率大高，甚至可实现手性分离；高效：分离效率大高，甚至可实现手性分离；3.高灵敏度：采用高灵敏度的检测器高灵敏度：采用高灵敏度的检测器;4.速度快：与经典液相色谱法相比，高效液相色速度快：与经典液相色谱法相比，高效液相色谱法所需的分析时间较少，一般少于谱法所需的分析时间较少，一般少于 1h；5.应用范围更广。应用范围更广。相同点：具分离和分析功能，均可以在线检测。相同点：具分离和分析功能，均可以在线检测。不同点：不同点：分析对象分析对象GC：适于能气化、热稳定性好、沸点较低的样品，适于能气化、热稳定性好、沸点较低的样品，不适于高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及不适于高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品。高聚物的样品。占有机物的占有机物的20%。HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限制，：不受样品挥发性和热稳定性的限制，适于适于溶解后能制成溶液的样品；分子量大、溶解后能制成溶液的样品；分子量大、难气化、热难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品。稳定性差及高分子和离子型样品。占有机物的占有机物的80%以上以上。流动相流动相GC：流动相为惰性气体，如：流动相为惰性气体，如H2、N2、He、Ar；组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。HPLC：流动相为液体；流动相为液体；流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度，增加了额外因素，如流动相极择性、改善分离度，增加了额外因素，如流动相极性、性、pH值、不同比例的两种或两种以上液体的配比。值、不同比例的两种或两种以上液体的配比。流动相种类较多，选择余地广。流动相种类较多，选择余地广。GC：加温操作。：加温操作。HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）。：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）。操作条件操作条件第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪主要部件：高压输液系统、进样系统、分主要部件：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。离系统和检测系统。辅助装置辅助装置：脱气机、梯度洗脱装置、自动脱气机、梯度洗脱装置、自动进样装置、数据处理系统。进样装置、数据处理系统。组成部件组成部件基本流程基本流程一、高压输液系统一、高压输液系统 包括：由贮液瓶、高压泵、脱气机、梯度包括：由贮液瓶、高压泵、脱气机、梯度洗脱等装置。洗脱等装置。1 1溶剂脱气装置溶剂脱气装置 作用：防止溶解在溶剂（流动相、试样）中作用：防止溶解在溶剂（流动相、试样）中的的N2、O2进入检测器而使噪声剧增。进入检测器而使噪声剧增。脱气方式：氦气鼓泡、超声波脱气、真空脱脱气方式：氦气鼓泡、超声波脱气、真空脱气等。气等。2 2高压泵高压泵作用：输送流动相。无脉动或脉动极小，保作用：输送流动相。无脉动或脉动极小，保证输出的流动相具有恒定的流速证输出的流动相具有恒定的流速。要求：要求：具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等。调、耐腐蚀等。作用：作用：分离过程中改变流动相的组成分离过程中改变流动相的组成，使，使所所有峰都获得最佳分离效果，分析时间缩短。有峰都获得最佳分离效果，分析时间缩短。基本方式：基本方式：高压梯度、低压梯度。高压梯度、低压梯度。2 2梯度洗脱梯度洗脱高压梯度：高压梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。后进入色谱柱。低压梯度低压梯度：一台高压泵台高压泵,通过比例调节阀通过比例调节阀,将两种将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。如双元梯度、四元梯度等。压泵中混合。如双元梯度、四元梯度等。二、进样系统二、进样系统进样方式：进样方式：隔膜注射器进样隔膜注射器进样 停留进样停留进样 阀进样阀进样 自动进样器进样自动进样器进样 1 1隔膜注射器进样隔膜注射器进样 色谱柱顶端装一耐压弹性隔膜，进样时色谱柱顶端装一耐压弹性隔膜，进样时用微量注射器刺穿隔膜将试样注入色谱柱。用微量注射器刺穿隔膜将试样注入色谱柱。优点：装置简单、价廉、死体积小。优点：装置简单、价廉、死体积小。缺点：是允许进样量小，重复性差，只缺点：是允许进样量小，重复性差，只能用于低压系统能用于低压系统(10MPa,(流动相极性流动相极性分离顺序：分离顺序：极性小的组分先出柱；极性小的组分先出柱；极性大的组分后出柱。极性大的组分后出柱。分离对象：分离对象：适于分离极性组分适于分离极性组分 反相色谱反相色谱固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性分离顺序：分离顺序：极性大的组分先出柱；极性大的组分先出柱；极性小的组分后出柱。极性小的组分后出柱。分离顺序：分离顺序：适于分离非极性组分适于分离非极性组分三、三、离子交换色谱离子交换色谱 固定相固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂 流动相流动相：阴离子阴离子离子交换树脂作固定相离子交换树脂作固定相酸性水溶液酸性水溶液 阳离子阳离子离子交换树脂作固定离子交换树脂作固定相相碱性水溶液碱性水溶液基本原理基本原理：组分在固定相上发生反复离子交换反应，：组分在固定相上发生反复离子交换反应，基于基于组分与离子交换剂之间亲和力的差异进行分离。组分与离子交换剂之间亲和力的差异进行分离。应用应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。选择性系数选择性系数注：注：Ks与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、离子交换树脂性质以及温度有关质、离子交换树脂性质以及温度有关 以阳离子离子交换为例：以阳离子离子交换为例：RSO3-H+X+RSO3-X+H+3333 SmSSSmSmRSO XHRSO XXKRSO HXRSO HH四、四、离子色谱离子色谱 传统离子交换色谱存在着两个难于解决传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：的问题：(1)(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。方法。1.1.离子色谱法原理离子色谱法原理 离子色谱法：以离子交换树脂为固定相，离子色谱法：以离子交换树脂为固定相，以电解质溶液为流动相，用于分离阴阳离子。以电解质溶液为流动相，用于分离阴阳离子。离子色谱中，应用最为广泛的的检测器离子色谱中，应用最为广泛的的检测器为电导检测器。为消除流动相中强电解质背为电导检测器。为消除流动相中强电解质背景离子对检测器的干扰，常设置一个抑制柱，景离子对检测器的干扰，常设置一个抑制柱，称为双柱型离子色谱法或化学抑制型离子色称为双柱型离子色谱法或化学抑制型离子色谱法。谱法。（1 1）分析速度快）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；可在数分钟内完成一个试样的分析；（2 2）分离能力高）分离能力高 在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。内，可使七种阴离子完全分离。（3 3）分离混合阴离子的最有效方法）分离混合阴离子的最有效方法（4 4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱五、五、离子对色谱离子对色谱 原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18(C-18柱柱)，含有对离子，含有对离子Y Y+的甲醇的甲醇-水或乙腈水或乙腈-水作为流动相，水作为流动相，试样离子试样离子X X-进入流动相后，生成疏水性离子对进入流动相后，生成疏水性离子对Y Y+X X-后；在两相间分配。后；在两相间分配。六、六、排阻色谱色谱排阻色谱色谱 固定相固定相：凝胶：凝胶(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)；原理原理：按分子大小分离。小分子可以扩散：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。，故在最后出峰。可对相对分子质量在可对相对分子质量在100-10100-105 5范围内的化范围内的化合物按质量分离合物按质量分离