高效液相色谱仪使用与操作规程学生用.ppt

高效液相色谱仪高效液相色谱仪使用与操作规程使用与操作规程第一步第一步第二步第二步第三步第三步第四步第四步准准备备开开机机 注意注意事项事项 清洁清洁 关机关机 步步 骤骤Agilent1100系统组成系统组成本系统由溶剂本系统由溶剂输送泵输送泵（四元泵，（四元泵，标配真空脱气机）标配真空脱气机）Rheodyne 7725i手动手动进样阀进样阀柱温箱柱温箱VWD紫外紫外-可见可见检测器检测器Agilent1100色谱数据色谱数据工作站工作站和和电脑电脑等组成，另外还包括打印机、等组成，另外还包括打印机、不间断电源等辅助设备。不间断电源等辅助设备。第一步、第一步、准准 备备1、准备所需的流动相，用合适的准备所需的流动相，用合适的0.45m滤膜滤膜过滤，超声脱过滤，超声脱气气20min。2、根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。量环。3、配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的的0.45m滤膜过滤。滤膜过滤。（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）4、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。常。接通电源，依次开启不间断接通电源，依次开启不间断电源电源、真真空脱气机空脱气机、四元泵四元泵、检测器检测器，待泵和检测，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最后打开色谱最后打开色谱工作站工作站。第二步、第二步、开开 机机一）一）参数设定参数设定1、波长设定波长设定：2、流速设定：流速设定：3、流动相比例设定：流动相比例设定：4、梯度设定梯度设定：二）二）更换流动相并排气泡更换流动相并排气泡1：将吸滤器放入装有准备好的流动相的储液将吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；瓶中；2：顺时针转动泵的排液阀顺时针转动泵的排液阀180，打开排液阀；，打开排液阀；3：运行泵，泵以运行泵，泵以3ml/min的流速冲洗的流速冲洗5min（可设定）后泵流速设为（可设定）后泵流速设为0ml/min；4：将排液阀逆时针旋转将排液阀逆时针旋转适度拧紧适度拧紧，关闭排液，关闭排液阀。阀。5：如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。气泡排尽。三）平衡系统三）平衡系统用检验方法规定的用检验方法规定的流动相冲洗系统流动相冲洗系统，一般最少需，一般最少需6倍柱体积倍柱体积的流动相。的流动相。检查各管路连接处检查各管路连接处是否漏液是否漏液，如漏液应予以排除。，如漏液应予以排除。观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过不超过1MPa。如。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按检查管路后再检查管路后再操作。操作。观察观察基线变化基线变化。如果冲洗至基线漂移。如果冲洗至基线漂移0.01mV/min，噪声，噪声为为25mmol/L25mmol/L的缓冲液的缓冲液4.4.每天冲洗柱每天冲洗柱5.5.稳定进样条件稳定进样条件,调节流动相调节流动相6.6.采用保护柱采用保护柱二、二、保留时间缩短保留时间缩短 1.流速增加流速增加2.样品超载样品超载3.键合相流失键合相流失4.流动相组成变化流动相组成变化5.温度增加温度增加1.1.检查泵检查泵,重新设定流速重新设定流速2.2.降低样品量降低样品量3.3.流动相流动相PHPH值保持在值保持在37.537.5检检查柱的方向查柱的方向4.4.防止流动相蒸发或沉淀防止流动相蒸发或沉淀5.5.柱恒温柱恒温三、三、保留时间延长保留时间延长 1.1.流速下降流速下降2.2.硅胶柱上活性点变化硅胶柱上活性点变化3.3.键合相流失键合相流失4.4.流动相组成变化流动相组成变化5.5.温度降低温度降低1.1.管路泄漏管路泄漏,更换泵密封圈更换泵密封圈,排除泵内排除泵内气泡气泡2.2.用流动相改性剂用流动相改性剂,如加三乙胺如加三乙胺,或采或采用碱至钝化柱用碱至钝化柱3.3.流动相流动相PHPH值保持在值保持在3 37.57.5检查柱的检查柱的方向方向4.4.防止流动相蒸发或沉淀防止流动相蒸发或沉淀5.5.柱恒温柱恒温四、出现肩峰或分叉四、出现肩峰或分叉 1.1.样品体积过大样品体积过大2.2.样品溶剂过强样品溶剂过强3.3.柱塌陷或形成短路通道柱塌陷或形成短路通道4.4.柱内烧结不锈钢失效柱内烧结不锈钢失效5.5.进样器损坏进样器损坏1.1.用流动相配样用流动相配样,总的样品体积小于第一峰总的样品体积小于第一峰的的15%15%2.2.采用较弱的样品溶剂采用较弱的样品溶剂3.3.更换色谱柱更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件采用较弱腐蚀性条件4.4.更换烧结不锈钢更换烧结不锈钢,加在线过滤器加在线过滤器,过滤样过滤样品品5.5.更换进样器转子更换进样器转子五、五、鬼峰鬼峰 1.进样阀残余峰进样阀残余峰2.样品中未知物样品中未知物3.柱未平衡柱未平衡4.三氟乙酸三氟乙酸(TFA)氧化氧化(肽谱肽谱)5.水污染水污染(反相反相)1.1.每次用后用强溶剂清洗阀每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品改进阀和样品的清洗的清洗2.2.处理样品处理样品3.3.重新平衡柱重新平衡柱,用流动相作样品溶剂用流动相作样品溶剂 (尤其是尤其是离子对色谱离子对色谱)4.4.每天新配每天新配,用抗氧化剂用抗氧化剂5.5.通过变化平衡时间检查水质量，用通过变化平衡时间检查水质量，用HPLCHPLC级的水级的水六、六、基线噪声基线噪声 1.气泡气泡(尖锐峰尖锐峰)2.污染污染(随机噪声随机噪声)3.检测器灯连续噪声检测器灯连续噪声4.电干扰电干扰(偶然噪声偶然噪声)5.检测器中有气泡检测器中有气泡1.1.流动相脱气流动相脱气,加柱后背压加柱后背压2.2.清洗柱清洗柱,净化样品净化样品,用用HPLCHPLC级试剂级试剂3.3.更换氘灯更换氘灯4.4.采用稳压电源采用稳压电源,检查干扰的来源检查干扰的来源(如水浴等如水浴等)5.5.流动相脱气流动相脱气,加柱后背压加柱后背压七、七、峰拖尾峰拖尾 1.柱超载柱超载2.峰干扰峰干扰3.硅羟基作用硅羟基作用4.柱内烧结不锈钢失效柱内烧结不锈钢失效5.柱塌陷或形成短路通道柱塌陷或形成短路通道6.死体积或柱外体积过大死体积或柱外体积过大7.柱效下降柱效下降1.1.降低样品量降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相增加柱直径采用较高容量的固定相2.2.清洁样品清洁样品,调整流动相调整流动相3.3.加三乙胺加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相降低流动相PHPH值值,钝化样品钝化样品4.4.更换烧结不锈钢更换烧结不锈钢,加在线过滤器加在线过滤器,过滤样品过滤样品5.5.更换色谱柱更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件采用较弱腐蚀性条件6.6.连接点降至最低连接点降至最低,对所有连接点作合适调整对所有连接点作合适调整,尽可尽可能采用细内径的连接管能采用细内径的连接管7.7.用较低腐蚀条件用较低腐蚀条件,更换柱更换柱,采用保护柱采用保护柱八、八、峰展宽峰展宽 1.进样体积过大进样体积过大2.在进样阀中造成峰扩展在进样阀中造成峰扩展3.数据系统采样速率太慢数据系统采样速率太慢4.检测器时间常数过大检测器时间常数过大1.1.用流动相配样用流动相配样,总的样品体积小总的样品体积小于第一峰的于第一峰的15%15%2.2.进样前后排出气泡以降低扩散进样前后排出气泡以降低扩散3.3.设定速率应是每峰大于设定速率应是每峰大于1010点点4.4.设定时间常数为感兴趣第一峰半设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的宽的10%10%八、八、峰展宽峰展宽5.流动相粘度过高流动相粘度过高6.检测池体积过大检测池体积过大7.保留时间过长保留时间过长8.柱外体积过大柱外体积过大9.样品过载样品过载5.5.增加柱温增加柱温,采用低粘度流动相采用低粘度流动相6.6.用小体积池用小体积池,卸下热交换器卸下热交换器7.7.等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱洗脱8.8.将连接管径和连接管长度降至最小将连接管径和连接管长度降至最小9.9.进小浓度小体积样品进小浓度小体积样品