高效液相色谱法2.ppt

1仪器分析仪器分析第第18章章 高效液相色谱法高效液相色谱法High performance liquid chromatography;HPLC(2)2o 高效液相色谱法的主要类型和原理高效液相色谱法的主要类型和原理o 高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择Introduction3 对流动相的要求对流动相的要求：不与固定相发生化学反应。对样品有适宜的溶解度。必须与检测器相适宜。粘度小2.化学键合相色谱法的流动相化学键合相色谱法的流动相4 n1/2 -1 k2 R=()()4 1+k2 n：由固定相及色谱柱填充质量决定 ：主要受溶剂种类的影响 k：主要受溶剂配比的影响(1)(1)溶剂系统对分离度的影响溶剂系统对分离度的影响5(2)(2)溶剂的强度和选择性溶剂的强度和选择性a.a.溶剂的极性和强度溶剂的极性和强度正相分配色谱：正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性，极性小流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离。的先流出，适于极性组分分离。反相分配色谱：反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性，极性大流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离。的先流出，适于非极性组分分离。6正相色谱正相色谱低极性流动相低极性流动相反相色谱反相色谱高极性流动相高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间时间时间时间时间待测物极性：待测物极性：ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系7b.b.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；柱子。如使固定液溶解流失；（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。检测器时，流动相不应有紫外吸收。8 GC：填充柱：H=A+B/u+Cu 毛细管柱：H=B/u+Cu HPLC：H=A+Cu3.分离条件的选择分离条件的选择(1)HPLC(1)HPLC中的速率理论中的速率理论9 A=2 dp A减小的措施：降低dp：35m 降低：球形、仄粒度分布固定相 高压、匀浆装柱a.a.涡流扩散涡流扩散(eddy diffusion)(eddy diffusion)10 B=2Dm Dm T/液 气 THPLC为室温 TGC Dm u最佳 (35倍）B/u 可忽略不计b.b.纵向扩散纵向扩散(longitudinal diffusion)(longitudinal diffusion)11C=Cm+Csm+Cs Cs：化学键合相，单分子层。C=Cm+Csm HPLC：H=A+Cm u+Csm u c.c.传质阻抗传质阻抗(mass transfer resistance)(mass transfer resistance)1213 Cm dp2/Dm Csm dp2/Dm C 减小的措施：降低dp 增大Dm：低粘度流动相低粘度流动相 增加柱温增加柱温14 流动相流速提高，色谱柱柱效降低（变化不如在GC中快）一般流量为1ml/min15HPLC的适宜条件：固定相与装柱：固定相与装柱：小粒度、均匀的球形键合相；匀浆法装柱。流动相流动相：低粘度、低流量。（甲醇,1ml/min)柱温柱温：25C16(2)(2)分离条件的选择分离条件的选择a.a.正相键合相色谱法的分离条件正相键合相色谱法的分离条件 一般以极性键合相为固定相，如氰基（分离含双键的化合物）、氨基键合相（分离多基团化合物如甾体、强心苷以及糖类）等 流动相通常采用烷烃加适量极性调节剂17b.b.反相键合相色谱法的分离条件反相键合相色谱法的分离条件 一般以非极性键合相和固定相 最常用ODS（C18），短链烷基键合相用于极性化合物的分离，苯基键合相适用于分离芳香化合物以及多羟基化合物（如黄酮苷类）流动相一般以极性最强的水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等极性调节剂 可选择弱酸（醋酸）、弱碱（氨水）或缓冲盐（磷酸盐、醋酸盐）调节pH，抑制组分理解，增强保留 调节流动相的离子强度也可改善分离效果18c.c.反相离子对色谱法的分离条件反相离子对色谱法的分离条件 C8或C18键合相为固定相 离子对试剂的选择 酸类或带负电荷的物质，常用季铵盐 分析碱类或带正电荷的物质，常用烷基磺酸盐 离子对试剂浓度一般在3-10mmol/L 流动相pH的选择 调节pH使试样组分与离子对试剂全部离子化194.分离类型选择分离类型选择20三、高效液相色谱仪三、高效液相色谱仪21流程流程动画动画221.输液系统输液系统(1)(1)高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性23 洗脱方式：洗脱方式：等强度洗脱：isocratic elution 在一个分析周期内流动相组成保持恒定。梯度洗脱：gradient elution 在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH等。(2)(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置24高压梯度高压梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。低压梯度低压梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。25(1)(1)进样器：六通进样阀进样器：六通进样阀 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：2.分离和进样系统分离和进样系统26(2)(2)高效分离柱高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。273.检测系统检测系统o 专属型检测器专属型检测器n 只能检测某些组分的某一性质n 紫外检测器、荧光检测器o 通用型检测器通用型检测器n 检测一般物质均具有的性质n 示差折光检测器、蒸发光散射检测器28p灵敏度高灵敏度高p噪音低噪音低p线性范围宽线性范围宽p重复性好重复性好p适用范围广适用范围广29 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。(1)(1)紫外检测器紫外检测器 ultraviolet detector;UVD ultraviolet detector;UVD30a.a.可变波长检测器可变波长检测器31b.b.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 photodiode array detector;PDADphotodiode array detector;PDAD 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。32光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器33化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的荧光；荧光强度（F）与激发光强度（I0）及荧光物质浓度（c）之间的关系为clQKIF03.2Q：量子产率K：荧光收集效率:摩尔吸光系数l：光径长度(2)(2)荧光检测器荧光检测器 fluorophotometric detector fluorophotometric detector；FDFD34 特点：灵敏度高（高于紫外检测器）只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质。是体内药物分析常用的检测器之一35(3)(3)安培检测器安培检测器 amperometric detector amperometric detector在电极间施加一恒定电位，当电活性组分经过电极表面时，发生氧化还原反应，产生电量（Q）的大小符合法拉第定律：Q=nFN。因此反应的电流（I）为dtdNnFI n：每摩尔物质在氧化还原过程中转移的电子数F：法拉第常数N：物质的摩尔数t：时间36(4)(4)蒸发光散色检测器蒸发光散色检测器 evaporative light scattering detector;ELSD 流动相（样品）加热流动相蒸发除去组分形成气溶胶强光测定散射光强 I=k mb37 特点：特点：通用型：如糖类、氨基酸等分析 适用于挥发性低于流动相的组分 灵敏度低 流动相必须是挥发的，不能含有缓冲盐38 组分+发光试剂 激发态产物 光辐射基态特点：灵敏度高 选择性高 不需光源(5)(5)化学发光检测器化学发光检测器39四、高效液相色谱分析方法四、高效液相色谱分析方法40 色谱鉴定法 化学鉴定法 两谱联用鉴定法(1)(1)定性方法定性方法色谱系统适用性内容：色谱系统适用性内容：塔板数、分离度、拖尾因子和重复性塔板数、分离度、拖尾因子和重复性41 外标法 内标法(2)(2)定量方法定量方法42例例1.用15cm长的ODS柱分离两个组分。柱效n=2.84104m-1；测得t0=1.31min；组分的tR1=4.10min；tR2=4.45min。（1）求k1、k2、R值。（2）若增加柱长至30cm，分离度R可否达1.5?40.231.131.145.4 13.231.131.110.4200101ktttttkRR13.113.240.212kk 426015.01084.24n4333.140.2140.213.1113.144620)1()1(422kknR（2）L2=30cm:88.115301.33 LLRR )(121221221LLRR