高美华医学免疫学补体结合实验.ppt

50%溶血试验（溶血试验（50%complement hemolysis,CH50）测定血清总补体）测定血清总补体活性活性 一、实验原理一、实验原理 补体最重要的活性是溶细胞作用。特异性补体最重要的活性是溶细胞作用。特异性抗体与红细胞结合可激活补体引起溶血，溶血抗体与红细胞结合可激活补体引起溶血，溶血程度与补体的活性相关。溶血反应对补体的剂程度与补体的活性相关。溶血反应对补体的剂量依赖呈一特殊的量依赖呈一特殊的S形曲线，该曲线在形曲线，该曲线在30%70%之间最陡，几乎呈直线，即此阶段之间最陡，几乎呈直线，即此阶段对补体量的变化非常敏感，因此实验常以对补体量的变化非常敏感，因此实验常以50%溶血作为判断终点来测定血清总补体活性，这溶血作为判断终点来测定血清总补体活性，这一方法称为补体一方法称为补体50%溶血实验（溶血实验（CH50）。）。二、试剂二、试剂1、绵羊红细胞（、绵羊红细胞（SRBC）：无菌采静脉血，除去纤维蛋）：无菌采静脉血，除去纤维蛋白后，洗涤配成白后，洗涤配成2%浓度应用。浓度应用。2、溶血素：抗绵羊红细胞抗体，需提纯后灭活补体。用、溶血素：抗绵羊红细胞抗体，需提纯后灭活补体。用稀释缓冲液稀释至稀释缓冲液稀释至2单位。单位。3、稀释缓冲液：、稀释缓冲液：PH7.4巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液 三、方法方法1、待检标本的处理：、待检标本的处理：取试管一支加待测血清取试管一支加待测血清0.20ml，加入，加入3.80ml pH7.4巴巴比妥缓冲液，使血清为比妥缓冲液，使血清为1：20稀释。稀释。2、取、取1列列10支试管，从支试管，从110编号，第编号，第19为测定管，第为测定管，第10管为对照管。按表进行加样。管为对照管。按表进行加样。3、50%溶血标准管溶血标准管 全溶管：全溶管：2%SRBC 1ml+4ml蒸馏水混匀静置蒸馏水混匀静置10min 50%溶血管：溶血管：2ml全溶管液体全溶管液体+2ml pH7.4巴比妥缓冲巴比妥缓冲液。液。4、上述所有试管经、上述所有试管经2500rpm，离心，离心5min后，与后，与50%溶溶血管肉眼初步比较，取较接近的血管肉眼初步比较，取较接近的2管进行比色，确定管进行比色，确定最接近最接近50%溶血管的管号。溶血管的管号。四、结果判断：四、结果判断：根据最接近根据最接近50%溶血管的管号，查出该管所加待溶血管的管号，查出该管所加待检血清标本量，按下列公式计算：检血清标本量，按下列公式计算：CH50（U/ml）=1/50%溶血管的血清用量（溶血管的血清用量（ml）稀释倍数稀释倍数正常范围：正常范围：50100 U/ml 补体结合试验补体结合试验（complement fixation test，CFT）一、原理一、原理 Ag和相应和相应Ab反应所形成的免疫复合物（反应所形成的免疫复合物（IC）能吸）能吸附（固定）并激活补体。附（固定）并激活补体。5种成份分属于：反应系统；种成份分属于：反应系统；补体系统；指示系统。补体系统；指示系统。反应、指示系统竞争结合补体系统。先加入反应反应、指示系统竞争结合补体系统。先加入反应系统，优先结合补体。若反应系统中待测的系统，优先结合补体。若反应系统中待测的Ab（或（或Ag）与已知与已知Ag（或（或Ab）相对应，则）相对应，则Ag与与Ab形成形成IC后可结后可结合补体；再加入指示系统时，因已没有游离的补体而合补体；再加入指示系统时，因已没有游离的补体而不出现溶血，为补体结合试验阳性。若不相对应，将不出现溶血，为补体结合试验阳性。若不相对应，将会有游离的补体参与指示系统的反应，最终会出现溶会有游离的补体参与指示系统的反应，最终会出现溶血现象，为阴性。血现象，为阴性。补体结合试验图示补体结合试验图示受检系统受检系统指示系统指示系统溶血反应溶血反应补体结合试验补体结合试验1、仅有抗原或抗体、仅有抗原或抗体补体补体红细胞红细胞溶血素溶血素阳性阳性阴性阴性2、抗原抗体反应、抗原抗体反应红细胞红细胞溶血素溶血素阴性阴性阳性阳性抗原抗体补体补体抗原抗原/抗体抗体二、试剂二、试剂1、受检抗原、抗血清（、受检抗原、抗血清（56 30min灭活，灭活，1:50稀释）。稀释）。2、补体（豚鼠新鲜血清，补体（豚鼠新鲜血清，2u）、）、1%绵羊红细绵羊红细胞（胞（SRBC）、）、溶血素（溶血素（2u）。）。3、生理盐水、试管、吸管、水浴、生理盐水、试管、吸管、水浴箱等。箱等。三、方法三、方法1、溶血素效价的滴定、溶血素效价的滴定按照下表操作按照下表操作以显示全溶的溶血素最高稀释度作为溶血素的效以显示全溶的溶血素最高稀释度作为溶血素的效价。价。在补体结合试验时，溶血素的效价也称之为在补体结合试验时，溶血素的效价也称之为1个个溶血素单位，在正式试验时一般采用溶血素单位，在正式试验时一般采用2个溶血素个溶血素单位。单位。管管 溶血素溶血素 2 单位单位 pH 7.4巴巴 2羊羊 号号 稀释度稀释度溶血素溶血素补补 体体 比妥缓冲比妥缓冲红细胞红细胞假定结果假定结果 1 1:300 0.25 0.15 0.85 0.25 放放全溶全溶2 1:400 0.25 0.15 0.85 0.25 置置全溶全溶3 1:500 0.25 0.15 0.85 0.25 37全溶全溶4 1:600 0.25 0.15 0.85 0.25 全溶全溶5 1:800 0.25 0.15 0.85 0.25 水水全溶全溶6 1:1000 0.25 0.15 0.85 0.25 浴浴全溶全溶7 1:1200 0.25 0.15 0.85 0.25 30全溶全溶8 1:1600 0.25 0.15 0.85 0.25 分分微溶微溶9 1:2000 0.25 0.15 0.85 0.25 钟钟微溶微溶10 1:2400 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶不溶11 1:3200 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶不溶12 1:4000 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶不溶13 1:4800 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶不溶14 1:6400 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶不溶2、补体滴定：一般用豚鼠补体，每次试验前均、补体滴定：一般用豚鼠补体，每次试验前均应滴定应滴定按照下表操作按照下表操作以能产生完全溶血的最少量的补体为以能产生完全溶血的最少量的补体为1个个“恰定恰定单位单位”，全溶第，全溶第2管为管为1个个“实用单位实用单位”。正式。正式试验时使用试验时使用2个实用单位。个实用单位。补补 体体 效效 价价 滴滴 定定 管管号号1:60补体补体(ml)pH 7.4巴巴比妥缓比妥缓冲液冲液(ml)稀释抗稀释抗原原(ml)注注1%致敏羊致敏羊红细胞红细胞(ml)注注假定结果假定结果10.010.290.1放放置置37水水浴浴10min0.2放放置置37水水浴浴30min不溶血不溶血20.020.280.10.2不溶血不溶血30.030.270.10.2不溶血不溶血40.040.260.10.2微溶血微溶血50.050.250.10.2微溶血微溶血60.060.240.10.2全溶（全溶（1个恰定个恰定单位）单位）70.080.220.10.2全溶（全溶（1个实用个实用单位）单位）80.100.200.10.2全溶全溶90.120.180.10.2全溶全溶100.150.150.10.2全溶全溶注注:为了排除抗原或抗体的抗补体作用，需在补体滴定的为了排除抗原或抗体的抗补体作用，需在补体滴定的同时加入抗原或抗体（如待检系统中以抗原测定未知同时加入抗原或抗体（如待检系统中以抗原测定未知抗体，需加入抗原，反之则加抗体）。抗体，需加入抗原，反之则加抗体）。注注:指稀释好的每指稀释好的每2 2单位溶血素与等量单位溶血素与等量2 2绵羊红细胞悬液绵羊红细胞悬液混合，置室温作用混合，置室温作用20203030分钟即可。分钟即可。效价计算：效价计算：从上表可以看出：0.06ml 1:60稀释的补体为1个“恰定单位”，0.08ml为1个“实用单位”。补体结合试验用2个“实用单位”，则0.16ml 1:60稀释补体相当于2个“实用单位”。由于正式试验时所加入的补体量为0.2ml，因此需按下公式算出所用补体的稀释倍数。0.082：600.2：X 600.2 X75 0.082 即将豚鼠血清用pH 7.4巴比妥缓冲液作1:75稀释后，每0.2ml中含2个实用单位的补体。3、抗原和抗体的滴定：、抗原和抗体的滴定：一般采用方阵滴定法，选择抗原与抗体均呈强一般采用方阵滴定法，选择抗原与抗体均呈强阳性反应的最高稀释度作为抗原和抗体的效价阳性反应的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（或单位）。正式试验时，抗原一般用（或单位）。正式试验时，抗原一般用24个个单位，抗体采用单位，抗体采用4个单位。个单位。4、补体结合正式试验、补体结合正式试验 按照讲义的表操作按照讲义的表操作应作抗原或血清对照管，应作抗原或血清对照管，SRBC、溶血素、溶血素对照管。对照管。四、结果观察四、结果观察1、管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内、管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。液体透明呈红色为溶血。2、第、第2、3、4管为对照管均应溶血，第管为对照管均应溶血，第5管为绵羊红细胞对照不应溶血。凡第管为绵羊红细胞对照不应溶血。凡第1管管红细胞发生溶血者为补体结合反应阴性，红细胞发生溶血者为补体结合反应阴性，而不溶血者为阳性。而不溶血者为阳性。五、实验报告五、实验报告掌握实验原理，记录并分析实验结果。掌握实验原理，记录并分析实验结果。溶血空斑形成实验溶血空斑形成实验（Plaque Forming test，PFT）小室液相法小室液相法一、原理一、原理 小鼠溶血空斑形成试验：取用绵羊红细胞小鼠溶血空斑形成试验：取用绵羊红细胞（SRBC）免疫过的小鼠脾细胞悬液，与）免疫过的小鼠脾细胞悬液，与SRBC和补体混合，灌入用玻片制备的透明小和补体混合，灌入用玻片制备的透明小室中，孵育后脾细胞可产生抗室中，孵育后脾细胞可产生抗SRBC抗体与其抗体与其周围的周围的SRBC结合，在补体的作用下，即可溶结合，在补体的作用下，即可溶解解SRBC而形成透明溶血区。而形成透明溶血区。检测实验动物抗体生成细胞产生检测实验动物抗体生成细胞产生IgM的能力。的能力。二、器材与试剂二、器材与试剂1、拨片、双面胶、拨片、双面胶2、细胞培养板、细胞筛等、细胞培养板、细胞筛等3、SRBC、豚鼠血清（补体）、豚鼠血清（补体）三、方法三、方法1、免疫小鼠、免疫小鼠2、制备脾细胞悬液、制备脾细胞悬液3、制备、制备10%SRBC4、补体制备、补体制备5、制备液相小室、制备液相小室6、正式实验、正式实验按讲义混合小室液，用毛细滴管灌入小室，灌满按讲义混合小室液，用毛细滴管灌入小室，灌满为止，用石蜡封边，为止，用石蜡封边，37 孵育孵育1.5小时。小时。四、结果判断四、结果判断用肉眼计数小室的空斑数。用肉眼计数小室的空斑数。计算计算20l脾细胞所形成的空斑数，设为脾细胞所形成的空斑数，设为X1。则；则；250：300=计数小室空斑数：计数小室空斑数：X1再再计算全计算全脾细胞所形成的空斑数，设为脾细胞所形成的空斑数，设为X2。则：则：20：6000=X1：X2空斑形成率空斑形成率=全全脾细胞所形成的空斑数脾细胞所形成的空斑数/全脾的脾细胞数全脾的脾细胞数X100%