2023年矮牵牛PhDFR基因和抗除草剂Bar基因植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化研究.docx
2023年矮牵牛PhDFR基因和抗除草剂Bar基因植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化研究摘要目的构建矮牵牛PhDFR基因的植物表达载体，并对烟草进行遗传转化。方法从不同花色的矮牵牛中克隆了2个PhDFR基因，通过目的基因序列克隆、多步载体酶切、连接、转化等技术手段，将其连入通用植物表达载体pCAMBIA2300及pCAMBIA3301o利用冻融法将重组质粒导入农杆菌GV3101继而转化烟草。结果构建了含卡那霉素抗性筛选标记基因NPTII和除草剂抗性筛选标记基因Bar的GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA2300PhDFRGFP和pCAMBIA3301PhDFRGFPo转基因植株的GUS染色结果进一步验证了所构建表达载体的正确性和好用性。结论所构建的表达载体为进一步探讨PhDFR基因在植物花色调控效应的功能及开展植物花色改良基因工程探讨奠定了基础，为植物基因工程科研工作供应了优良的备选植物表达载体。关键词DFR基因；植物表达载体；烟草遗传转化；Bar中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611(2023)17-05380-05AbstractObjectiveTheaimwastoconstructaplantexpressionvectorcarryingPetuniasPhDFRgeneandtogeneticallytransformitintotobacco.MethodTwoPhDFRgenewasclonedfromPetuniavarietieswithdifferentflowercolorinthepreviousstudy.Throughmultitechnicalmethodsincludingsequencecloningoftargetgenes,doubleenzymedigestion,plasmidvectorconnectionandtransformation,targetgenePhDFRwereintroducedintotheplantexpressionvectorpCAMBIA2300andpCAMBIA3301.ThesevectorsweregeneticallytransformintoAgrobacteriumtumefactionsstrainGV3101andthenappliedingenetictransformationoftobaccorecipientplants.ResultTheplantoverexpressionvectorscarryingtargetgenesPhDFR,includingpCAMBIA2300PhDFRGFPwhichcontainedkanamycinresistanceselectionmarkergeneNPTIIandGFPfusedgene,andpCAMBIA3301PhDFRGFPwhichcontainedBastaresistancemarkergeneBarandGFPfusedgene,weresuccessfullyconstructed.ThecorrectnessandpracticabilityofexpressionvectorconstructwerefurtherverifiedbyGUSstaininganalysisoftransgenicplantsfurther.ConclusionTheconstructedplantoverexpressionvectorsprovideafoundationforfurtherstudyonthefunctionofPhDFRgenesinregulatingplantflowercolorandgeneticengineeringrelatedtomodificationofplantflowercolor.Thisstudyalsoprovidedexcellentalternativeplantexpressionvectorsforplantgeneticengineeringwork.KeywordsDFRgene；Plantexpressionvector；Tobaccogenetictransformation；Bar自然界中的花色素主要有3大类群：类黄酮类、类胡萝卜素类和生物碱类1,而类黄酮类色素中的花色素甘(anthocyanin)是影响花色的主要色素，限制着花的粉红色、红色、紫罗兰色和蓝色2。植物花青素合成途径已经为人们所熟识，类黄酮生物合成途径中花色素背形成如图1所示。花青素合成大致可以分为3个阶段3-6,第1阶段由苯丙氨酸到4-香豆酰CoA,这是苯丙烷类次生代谢途径所共有的;第2阶段是类黄酮代谢的关键反应，由4-香豆酰CoA和丙二酰CoA到二氢堪非醇，该阶段产生的黄烷酮和二氢堪非醇在不同酶作用下，可转化为花青素和其他类黄酮物质；第3阶段由二氢黄酮醇到各种花青素的合成，其中有关的酶如类黄酮3,羟化酶、类黄酮3,，5,羟化酶、二氢黄酮醇还原酶，花青素合成酶ANS和类黄酮3葡糖基转移酶3GT,在这个过程中，花色素经过各种甲基化、糖基化、羟基化等等反应，最终形成了稳定的花色素甘，各种不同的花色素昔的比例最终确定了植物的外观颜色。在花色素昔合成途径中，从第2到第3阶段的转变中，由第2阶段产生的黄烷酮和二氢堪非醇，可以在不同的酶作用下，或者进入花青素合成途径，或者合成其他类黄酮物质，此过程中二氢黄酮醇还原酶（DFR）在花色素甘合成途径中起着关键的作用，由DFR作用得到的产物，将作为后续合成花色素昔的底物，从而最终形成各种稳定的花色素甘。DFR的氨基酸序列确定了其底物的种类，不同物种中DFR与底物的结合区域是高度保守的，其中第134位氨基酸残基干脆确定底物的特异性7。由于不同物种的DFR对底物选择性不同，所以合成不同的花色素，呈现的花色各异8。试验室在前期探讨中，从不同花色（红色及蓝色）矮牵牛（Petuniahybrid）品种材料中克隆到了2个序列有所差异的PhDFR基因，为了进一步探讨PhDFR基因在类黄酮/花色昔生物合成中的作用及不同DFR基因对植物花色性状的影响,笔者分别构建卡那霉素及除草剂BASTA筛选标记的PhDFR基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合的植物表达载体，对烟草进行遗传转化，验证其功能，以期为植物花色改良相关基因工程供应候选基因及备选植物表达载体。1材料与方法1.1材料1.1.1探讨对象。烟草（NiCotianatabacumcv.PetitHavanaSRD种子，为中国科学院新疆理化技术探讨所植物资源化学探讨室保存。1.1.2菌株和质粒。大肠杆菌（ESCheriChiaCOli）菌株DH50、根癌农杆菌（Agrobactriumtumefaciens）菌株GV3101及植物表达载体PCAMBlA23000CS、pCAMBIA33010CS,均为试验室保存；含有外源基因FT与绿色荧光蛋白GFP融合的双元质粒载体pCAMBIA2300FTGFP,由石河子高校生命科学学院黄先忠老师赠与。克隆载体TVeCtorPMDl9Simple,购自大连宝生物公司；目的基因PhDFR2（克隆自红色矮牵牛品种，GenBank登录号：KC46484）及PhDFR3（克隆自蓝色矮牵牛品种，GenBank登录号：KC464485）保存于克隆载体pGEMPhDFR2和pGEMPhDFR3中。1.1.3主要试剂。PCR所用的酶EsTaqDNAPolymerase及buffer,购自康为世纪；连接酶T4DNALigase、Xgal、IPTG、DNA/EcoRI+HindIIIMarkerDL2000Marker,购自宝生物（大连）公司；限制性内切酶选用ThermoScientificFastDigest,购自美国Thermo公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；测序及引物合成，均托付上海生工生化试剂有限公司；BAR基因筛选剂Basta（活性成分为草丁瞬PPT,Phosphinothricin）氨苇青霉素(Ampicillin)及卡那霉素Ckanamycin),购自Sigma公司；6年基腺喋吟(6BA)、口引睬乙酸(IAA)以及细菌培育基为进口分装，其他相关试剂均为国产分析纯，市售。1.2方法1.2.1 目的基因序列的克隆。利用试验室已经保存的PGEMPhDFR2和PGEMPhDFRS载体为模板(己测序)，因为2个DFR基因的编码区两侧碱基序列完全一样,设计带KpnIXbalI酶切位点的引物PhDFRF：GGTACCATGGCAAGTGAAGCAGTTC和PhDFRR：TCTAGAGACTTCAACATTGCTTAACATT,用PCR制备带有酶切位点目的基因编码区的插入片段，选用20l的PCR体系，包括IOXPCRbuffer2l,dNTPs(10mmolL)0.5l,上下游引物(10molL)各1l,EstaqDNAPolymerase(5U1)0.2l,模板质粒0.5l,ddH2014.8lo扩增程序：95预变性3min；94,30s；55,30s；72,75s；35个循环；72延长5minoPCR产物在琼脂糖凝胶(1.0%)中电泳检测并回收，并连接到TVectorPMD19simple载体中，转化大肠杆菌DH5,通过蓝白斑筛选，挑取白斑，运用菌落PCR验证后送公司进行测序，含有目的基因的新载体命名为pMD19PhDFR2和pMD19PhDFR3o1.2.2 表达载体pCAMBIA2300PhDFR2GFP和pCAMBIA2300PhDFR3GFP的构建。用KpnlXball酶切体系对pMD19PhDFR2>pMD19PhDFR3>PCAMBlA2300FTGFP载体进行双酶切，然后电泳、回收目的基因片段及载体骨架片段，用T4DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌DH5,卡那霉素筛选阳性克隆，运用菌落PCR和质粒酶切验证确定正确的重组子,构建的重组质粒命名为pCAMBIA2300PhDFR2GFP和pCAMBIA2300PhDFR3GFPo1.2.3 表达载体pCAMBIA3301PhDFR2GFP和pCAMBIA3301PhDFR3GFP的构建。对pCAMBIA3301OCS和2300PhDFR3GFP进行EcoRIPstI双酶切，电泳并回收pCAMBIA3301骨架部分及PhDFR3载体小片段(含目的基因表达盒)，连接转化大肠杆菌DH5a,卡那霉素筛选阳性克隆,并提取质粒进行酶切验证，构建的重组质粒命名为pCAMBIA3301PhDFR3GFPo对已经构建好的pCAMBIA3301PhDFR3GFP和PCAMBlA2300PhDFR2GFP进行ECORIXbal的双酶切，电泳并回收pCAMBIA3301PhDFR3GFP大片段及PhDFR2载体小片段，连接转化大肠杆菌，对阳性克隆提取质粒进行酶切验证，构建的重组质粒命名为pCAMBIA3301PhDFR2GFPo1.2.4 重组质粒转化根癌农杆菌。利用冻融法将重组质粒pCAMBIA3301PhDFR2GFP和pCAMBIA3301PhDFR3GFP转化到农杆菌(Agrobactriumtumefaciens)菌株GV31019,阳性克隆经过PCR验证后长期保存。1.2.5 表达载体对烟草的遗传转化及转基因植株鉴定。烟草的遗传转化及转基因植株中报告基因GUS的分析检测，参照文献10进行。不定芽诱导和选择培育基为MS基本培育基附加2mg/L6BA+0.1mg/LNAA+10mg/LBasta+400mg/L装苇青霉素+3%蔗糖+7g/L琼脂。生根培育基为MS基本培育基附加15mg/LBasta+400mg/L竣苇青霉素+3%蔗糖+7g/L琼脂。
