雌激素对脊髓损伤大鼠运动功能及GAP-43表达的影响.docx

雌激素对脊髓损伤大鼠运动功能及GAP43表达的影响周邦瑜张磊李颖李绍波*(大理大学临床医学院，大理，云南，671000)作者简介：周邦瑜(1996年-)硕士研究生在读，主要从事脊柱外科研究。(Email：)联系电话：基金项目：云南省教育厅科学研究基金会项目(2022Y865)*通讯作者，教授，硕士研究生导师，【摘要】目的：探讨雌激素对脊髓损伤(SPinaICordinjUry,SCI)大鼠后肢运动功能和损伤区域生长相关蛋白-43(GrOWth-ASSoCiatedProtein43,GAP-43)表达的影响。方法：SD大鼠随机分为假手术组(A组)、生理盐水模型组(B组)、雌激素组(C组)，B、C制作SCl模型，B组等量生理盐水腹腔注射，C组雌激素腹腔注射。术后3d、lw、2w、3w检测BBB评分和RiVIin斜板试验。术后各时间点处死大鼠取脊髓组织，行免疫组织染色观察GAP-43的表达情况，所有的结果采用单因素方差分析，进一步使用LSD法进行各组间比较。结果：C组BBB评分在术后lw、2w、3w评分结果分别为(9.67±0.30)分、(14.06±0.69)分、(16.46±0.39)分,B组分别为(4.28÷0.15)分、(6.93±0.50)分、(8.95±0.34)分，相同时间点比较C组均比B组高，差异存在统计学意义CP<0.05)；C组RiVlin斜板试验在术后lw、2w、3w评分结果分别为(29.83±0.66)o、(40.16÷0.76)o、(49.00÷1.48)o,B组分别为(24.60±0.63)°、(27.58÷0.79)°、(30.51÷1.18)°,相同时间点比较C组均比B组高，差异存在统计学意义(P<0.05)；C组GAP-43阳性细胞表达数在术后3d、lw、2w、3w分别为(23.38±0.40)、(31.14±0.86)>(18.78+0.37(9.87÷0.44),B组分别为(15.93±0.59)、(26.45±0.69)>(13.61+0.43)4.59+0.47),相同时间点比较C组均比B组高，差异存在统计学意义(PV0.05),结论：雌激素能促进脊髓损伤大鼠的运动功能的恢复，其机制可能是通过增加脊髓损伤区域GAP-43的表达，促进神经的修复和再生。【关键词】雌激素；脊髓损伤；运动功能；GAP-43【中图分类号】R683.2【文献标识码】AEffectsofestrogenonmotorfunctionandGAP-43expressioninratswithspinalcordinjuryZHOUBangyuZHNAGLeiLIYingLlShaobot(CollegeofClinicalMedicine,DaliUniversity,Dali671000,Yunnan,China)Abouttheauthor:ZHOUBangyu(1996-)isapostgraduatestudent,mainlyengagedinspinesurgeryresearch.(Email：)Tel:*Correspondingauthor,Professor,supervisorofspinalsurgery,(AbstractObjective:Toinvestigatetheeffectsofestrogenonhindlimbmotorfunctionandtheexpressionofgrowth-associatedProtein43(GAP-43)intheinjuredareaofratswithspinalcordinjury(SCI).Methods:SDratswererandomlydividedintoshamoperationgroup(groupA),nonnalsalinemodelgroup(groupB)andestrogengroup(groupC).SClmodelwasmadeinBandC,andthesameamountofnormalsalinewasinjectedintraperitoneallyingroupBandestrogenwasinjectedintraperitoneallyingroupC.BBBscoreandRivlininclinedplatetestweredetectedat3rdday,lsl,2nd,3rdweekafteroperation.TheratsweresacrificedateachtimepointafteroperationandthespinalcordtissueswereharvestedforimmunohistochemicalstainingtoobservetheexpressionofGAP-43.AlloftheresultswasuseSinglefactoranalysisofvariancefirst,andthenLSDtestwasusedforpairwisecomparisonbetweengroups.Results:TheBBBscoresofgroupCat1sl,2nd,3rdweekafteroperationwererespectively(9.67÷0.30)(14.06±0.69)、(16.46+0.39),groupBisrespectively(4.28±0.15)、(6.93±0.50)、(8.95±0.34),atthesamepointintime,groupCwashigherthangroupB,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).IngroupC,thescoresofRivlininclinedplatetestat1sl,2nd,3rdweekafteroperationwererespectively(29.83÷0.66)o、(40.16÷0.76)o、(49.00±1.48),groupBisrespectively(24.60±0.63)、(27.58÷0.79)、(30.51÷1.18),atthesamepointintime,groupCwashigherthangroupB,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).TheexpressionnumbersofGAP-43positivecellsofgroupCat3rdday,1'2nd,3rdweekafteroperationinwererespectively(23.38÷0.40)、(31.14÷0.86)、(18.78+0.37)、(9.87±0.44),groupBisrespectively(15.93÷0.59)、(26.45±0.69)>(13.61+0.43)、(4.59±0.47),atthesamepointintime,groupCwashigherthangroupB,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).Conclusion:Theestrogencanpromotetherecoveryofmotorfunctionintheratspinalcordinjury,itsmechanismisprobablybyincreasingtheexpressionofGAP-43oftheareaofSCI,promotingnerverepairandregeneration.Keywords:Estrogen;Spinalcordinjury;Motorfunction;GAP-43脊髓损伤（SPinaIcordinjury,SCl）是由多种因素引起损伤部位以下感觉、运动和自主神经功能障碍UZ,严重影响患者的健康和生活质量，治疗主要有尽早的进行减压手术、使用激素、血管活性药物、细胞移植、神经刺激等方法14-61o雌激素是类固醇激素，研究表明可通过抑制神经元凋亡，有助于修复SCl后大鼠的运动功能，但雌激素是否能促进神经生长，目前研究并不透彻。生长相关蛋白43（GroWth-ASSc）CiatedProtein43,GAP-43）是神经元再生的标志物之一。雌激素能否调节GAP-43的表达、改善Sel大鼠运动功能目前报道较少，因此本研究拟通过雌激素干预SCl大鼠，探讨GAP43在雌激素改善SCl大鼠后肢运动功能中的作用，为SCl的治疗提供新的参考。1、材料和方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物雄性SD大鼠72只，体重200g-250g,随机分三组。A组为假手术组，仅仅打开椎板不做SCI；B、C两组建造SCl模型，其中B组为生理盐水模型组（等量生理盐水腹腔注射）、C组为雌激素治疗组（术后30min、Id、2d腹腔注射剂量为4mgkg己烯雌酚），B、C两组每组根据时间分为术后3d、lw、2w、3w共4个小组，每个小组6只。1.1.2 实验试剂己烯雌酚注射液（批号：100103,上海通用药业股份有限公司），抗原修复液、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），戊巴比妥钠（北京化学试剂公司）。1.2 实验方法1.2.1 动物模型大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠40mgkg麻醉，A组仅打开T3L5椎板，不做SCIoB、C两组根据改良AllenS重物打击法造模。以最后一根肋骨为标记，行背部正中切口，逐层分离椎旁肌肉暴露椎板，止血钳咬除T3L5全部椎板，显露出硬脊膜。硬脊膜表面放置贴合脊髓弧度的铜质垫片，距脊髓表面2cm的高度将直径为2cm、重量为20g的金属杆自由落体垂直的撞击垫片，损伤结束后逐层关闭切口。造模成功标准：大鼠脊髓受撞击后，脊髓组织出血、水肿，出现双下肢瞬时抖动和摆尾反射。术后每天一次腹腔注射青霉素8万单位预防感染，连续3天。1.2.2 BassoBeattieBresnahanscale（BBB）评分各组分别在SCl后3d、lw、2w、3w进行双盲法BBB评分并记录，将大鼠放置在水平地面上行走，通过观察大鼠踝关节、膝关节、股关节的行走姿态和四肢整体运动协调动作情况进行评分1期。重复测量数据，取平均值。1.2.3Riylin斜板试验自制75CmX60CmX1.5Cm的长方形斜板测试大鼠在斜板上的抓握力、维持身体姿势的能力，记录斜板每次升高时大鼠停留5秒的斜板角度数值。各组分别于SCl后3d、lw、2w、3w双盲法重复测量数据，取平均值。1.2.4 动物灌注各组术后3d、lw、2w、3w不同时间点进行灌注，麻醉后暴露心脏，自制灌注器插入左心室、剪破右心耳进行灌注。先用PBS液灌注，接着快速灌注4%多聚甲醛，此时出现肢体和尾部抽动，抽动停止后持续缓慢灌注。大鼠肝脏变白硬化，四肢及尾巴变硬时灌注结束。迅速以损伤点为中心取出约2cm脊髓，整个过程约40min01.2.5 免疫组织化学染色法(immunohistochemicabIHC)检测GAP43蛋白的表达脊髓组织行石蜡包埋，切片后烤片、脱蜡。过氧化氢孵育灭活内源性酶、抗原修复、5%山羊血清37孵育30min0轻轻甩去山羊血清后GAP-43抗体(1:50)37孵育30min,洗去一抗后二抗孵育30min,洗去二抗后SABC试剂孵育30min°DAB染色IOmin,素木精染2min,再次脱蜡、封片。HMlAS-2000分析系统GAP-43阳性细胞重复计数，求其平均值。2 .统计学分析所有数据均通过SPSS25.0软件完成统计和分析，实验数据用Sis表示，选用单因素方差分析(One-WayANOVA)进行多组间比较，进一步采用LSD法两两比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。3 .结果3.1 BBB