红景天促进大鼠烫伤创面模型皮肤愈合作用机制研究.docx

红景天促进大鼠烫伤创面模型皮肤愈合作用机制研究张同威I,郑文杰2,刘岩I,安立辉I1、沈阳市第七人民医院皮肤科，辽宁沈阳II(X)O32、中国医科大学附属第一医院皮肤科，辽宁沈阳I100ol【摘要】目的：探讨红景天对大鼠烫伤创面的愈合效果及其作用机制。方法：建立大鼠11度烫伤模型，90只大鼠随机分为阳性对照组(磺胺喀咤银软管单)、模型组、红景天低(7mgkg)、中(7.5mgkg)、高剂量(10mg/kg)组，以18只正常大鼠为对照组。在第7天、14天、21天观察大鼠烫伤创面的愈合情况以及检测创面组织含水量；给药结束后,HE染色观察大鼠创面组织病理学变化；ELISA法检测创面组织中Conangen-I水平、羟脯氨酸(HYP)及血清中、白细胞介素-l(IL-Ip)、肿瘤坏死因子-(TNF-)含量；Westernblot检测创面组织表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达。结果：与对照组相比，模型组大鼠创面组织表皮细胞脱落，炎性细胞浸润，胶原纤维排布散乱，ColIangen-I水平、HYP含量、EGF.bFGF蛋白表达水平均降低(P<0.05),含水量、TNF-a、IL-l水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，红景天低、中、高剂量组在不同程度上减轻了创伤大鼠的炎症反应，提高第7天、14天、21天创面愈合率以及HYP含量、Conangen-I水平、EGF、bFGF蛋白表达水平(P<0.05),缩短愈合时间，降低含水量、TNF-C1、IL-IP水平(PVO.05)。结论：红景天可促进烫伤模型大鼠创面愈合，其作用机制可能与抑制炎症反应，提高组织胶原蛋白合成有关。【关键词】红景天；烫伤大鼠；创面愈合；炎症反应ResearchontheMechanismofRhodiolaPromotingtheSkinHealingofRatModelsofScaldedWoundZhangTongweil,ZhengWenjie2,LiuYananLihui1!.DepartmentofDermatology,ShenyangSeventhPeople,sHospital,Shenyang110003,Liaoning2.DepartmentofDermatology,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,LiaoningAbstractObjective:ToinvestigatethehealingeffectofRhodiolaonscaldedwoundsinratsanditsmechanism.Methods:Ninetyratswererandomlydividedintopositivecontrolgroup(silversulfadiazineointment),modelgroup,rhodiolalow-dose(7mg/kg),medium-dose(7.5mg/kg)andhigh-dose(10mg/kg)groups,and18normalratswereusedascontrolgroupThehealingofscaldedwoundsinratswasobservedonthe7th,14th,and21stdays;aftertheadministration,HEstainingwasusedtoobservehistopathologicalchangesinthewoundsofrats;ELISAwasusedtodetectCollangen-Ilevel,hydroxyproline(HYP)contentinwoundtissuesandtheserumtumornecrosisfactor-(TNF-a),interleukin-l(IL-l)contents;Westernblotwasusedtodetecttheexpressionofepidermalgrowthfactor(EGF)andbasicfibroblastgrowthfactor(bFGF)inwoundtissuesofratsineachgroup.Results:Comparedwiththecontrolgroup,thewoundtissueepidermalcellsofratsinthemodelgroupfelloff,inflammatorycellsinfiltrated,collagenfibersarrangedindisorder,theCollangen-Ilevel,HYPcontent,andEGFandbFGFproteinexpressionlevelsreduced(P<0.05),theTNF-andIL-llevelsincreasedsignificantly(P<0.05);comparedwiththemodelgroup,theRhodiolalow,mediumandhighdosegroupsalleviatedtheinflammatoryresponseoftraumaticratstovaryingdegrees,improvedthewoundhealingrateonthe7th,14thand21stdays,HYPcontent,Collangen-Ilevel,andEGFandbFGFproteinexpressionlevels（P<0.05）,shortenthehealingtime,reducetheTNF-andIL-llevels（P<0.05）.Conclusion:Rhodiolacanpromotewoundhealinginscaldmodelrats,anditsmechanismofactionmayberelatedtoinhibitinginflammationandimprovingtissuecollagensynthesis.KeywordsRhodiola;scaldedrats;woundhealing;inflammatoryreaction烧伤和烫伤指的是患者接触温度较高的液体、金属、蒸汽或者气体导致的皮肤损伤，其发病率约为1.5%-2%3,轻者表现为红肿，损伤皮肤表层，严重者会出现水泡，创面发白或者呈灰褐色，骨骼、肌肉、器官均会出现不同程度的损伤，严重者影响危其生命安全，因此研究烧烫伤的作用机制和发掘有效治疗药物尤为重要。目前治疗烧伤和烫伤主要以抗生素和银盐为主的西药，这些药物不仅消炎、杀菌等作用效果差，还存在一定不良反应，而副作用小的中草药逐渐成为烧烫伤研究的重点。红景天又称蔷薇红景天，属多年生草本植物，具有抗病毒、抗炎、抗疲劳、抗氧化、保护血管等药用价值，应用前景较为广泛。本实验通过建立烫伤大鼠模型，使用红景天干预，观察大鼠创面愈合情况、炎症因子水平、蛋白表达情况，以揭示红景天对烫伤大鼠皮肤愈合的作用机制。方法1.l材料1.1.1 实验动物维通达生物技术有限公司提供清洁级SD大鼠108只，7周龄左右，体重约为210-260g,生产许可证：SCXK（京）2019-0002O所有大鼠自由进食进水，环境控制20±2C,湿度50%。本研究经动物伦理委员会批准。1.1.2 实验试剂与仪器红景天胶囊（货号：）购自佳汇泰生物科技开发有限公司；肿瘤坏死因子-（tumournecrosisfactor-,TNF-a）（货号：ml002859）、羟脯氨酸（HYP）（货号：ml003360）、白细胞介素-IP（interleukin-l,IL-l）（货号：ml003057）ELlSA试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；胶原蛋白-I（Collangen-I）ELlSA试剂盒购自于上海瑞番生物科技有限公司；兔抗鼠EGF、兔抗鼠bFGF（货号：ab184265sab208687）购自于abeam公司。磺胺嗑咤银软膏（产品编号：80501）购自昆明华润圣火药业有限公司。尼康SMZ745光学显微镜购自于上海普赫生物科技有限公司；三用恒温水浴箱购自上海赫田科学仪器有限公司；酶标仪购自上海美谷分子仪器有限公司。1.2 方法1.2.1 模型制备、分组所有大鼠术前禁食24h,采用周丽艳等烫伤大鼠模型方法造模。操作过程：剪去所有大鼠背部体毛（直径约4cm）,清洗、消毒，经腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，将大鼠背部放置于中间掏空的木板上、暴露脱毛区，将脱毛区浸入80的恒浴水箱中，保持15s,造成大约直径3cm的烫伤区域，当模型大鼠烫伤区域局部发白，出现水肿现象，提示造模成功。90只大鼠随机分为红景天低剂量（5mgkg）组、红景天中剂量（7.5mgkg）组、红景天（10mgkg）高剂量组、模型组、阳性对照（磺胺嗑咤银软膏，1g）组，以18只正常大鼠为对照组。药物组分别以相应剂量红景天腹腔注射，阳性对照组给予磺胺嗑咤银软膏外敷治疗，对照组和模型组大鼠给予生理盐水注射，1天/次，连续21天。1.2.2 创面愈合相关指标模型构建成功后，每组随机选取3只大鼠，每日观察大鼠创面愈合情况，记录创面完全上皮化时间；在给药第7天、14天、21天，各组随机选取6只大鼠，拍照分析大鼠创面面积，计算创面愈合率，创面愈合率=（原烫伤面积-未愈合烫伤面积）/原烫伤面积×oo%;创面愈合率分析结束后，除需要观察创面愈合的大鼠外，其余大鼠经腹部取血保存，用于后续ELISA检测；之后采用颈椎脱臼方法处死大鼠，取烫伤部位创面组织，一式两份，一份用生理盐水冲洗，置于10%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色；另一份置于-80冰箱中保存，用于后续检测。1.2.4 创面组织含水量测定每组选取3只大鼠，麻醉并处死后切取创面皮肤组织，冲洗干净后称重（WI）,80烤箱烘烤24h至恒重后称量（W2）,含水量（）=（Wl-W2）AVl×100%1.2.5HE染色观察大鼠创面组织病理学变化取上述1.2.2中适量创面组织，常规方法制备石蜡切片，经固定、脱水、染色、透明后封片，于镜下观察组织病理变化。1.2.6 ELISA法检测大鼠血清中TNF->IL-I水平及创面组织中Collangen-1HYP含量取上述1.2.2中储存血液及适量创面组织，离心取上清，按照EUSA试剂盒说明书进行检测CoHangen-I、HYP及TNF-a、IL-I水平。1.2.7 Westernblot法检测创面组织EGF、bFGE表达水平取1.2.2适量创面组织，提取组织总蛋白并对蛋白进行定量、电泳分离、转膜、抗体封闭后，分别按照1：2000稀释后加入兔抗鼠EGF、兔抗鼠bFGF并于4°C孵育过夜；经TBST洗涤，加入二抗室温孵育lh,ECL可视化蛋白，ImageJ软件蛋白表达水平。1.3 统计学分析SPSS22.0软件统计分析数据，计量资料以（元±s）表示，PV0.05时，代表差异具有统计学意义。单因素方差分析多组间数据，进一步比较用Snk-q检验。2 .结果2.1 比较各组大鼠创面愈合状况与模型组大鼠相比，红景天低、中、高剂量组大鼠创面愈合时间明显缩短（PV0.05）,第7天、14天、21天创面愈合率显著性增加（PVO.05）,随着红景天剂量的增加，创面愈合时间逐渐缩短，创面愈合率呈增加趋势；红景天高剂量组愈合指标与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；同组之间，第7天、14天、21天的创面创面愈合率两两相比，差异均具有统计学意义（PV0.05）。见表1。表1红景天对大鼠创面愈合指标的影响（无±s,n=3）组别创面愈合时间（d）创面愈合率（%）7d14d21d模型组27.23±3.1521.61±1.57