高良姜素对肺癌细胞H1299的抑制作用及机制研究.docx
高良姜素对肺癌细胞H1299的抑制作用及机制研究廖秀珊海南博鳌一龄生命养护中心检验科，海南琼海571400【摘要】目的探讨高良姜素对肺癌细胞H1299的抑制作用及机制研究。方法取对数生长期的H1299细胞铺板于96孔板中，采用不同浓度高良姜素(0、2.5、5、10、20、40、80molL)处理24h,采用MTT法检测高良姜素对H1299细胞增殖的影响，计算半数抑制浓度(IC50),取0、1/2、1/4、1/8IC50(0、25、12.5、6.25molL)分为高、中、低剂量高良姜素进行后续实验，采用流式细胞术、免疫印迹法检测H1299细胞的凋亡率和Wnt3a、-catenin.Bax、Bcl-2的蛋白表达。结果与对照组相比，580molL高良姜素细胞均可显著抑制肺癌细胞H1299细胞增殖，差异具有统计学意义(P<0.05);采用拟合曲线法计算得到，高良姜素IC5=50molL00molL高良姜素细胞凋亡率、Wnt3a、-catenin>BaX和Bcl-2蛋白表达水平分别为(4.23+0.45)%、(1.77±0.07)>(2.51±0.15)>(0.56+0.09)(1.89±0.12),6.25molL高良姜素细胞凋亡率、Wnt3a、-catenin.Bax和Bcl-2蛋白表达水平分别为(9.02±1.01)%、(0.97±0.11)>(0.99÷0.05)>(0.89÷0.04)>(1.21÷0.09),12.5molL高良姜素细胞凋亡率、Wnt3a、-cateninBax和Bcl-2蛋白表达水平分别为(18.48±2.33)%、(0.56÷0.07)s(O.88±O.ll)s(1.21±0.1D(0.88±0.10),25molL高良姜素细胞凋亡率、Wnt3a、-catenin、Bax和Bcl-2蛋白表达水平分别为(26.44÷1.17)%、(0.31÷0.04)s(0.43±0.05)>(1.79±0.21)、(0.28÷0.07),与对照组相比，低、中、高剂量组高良姜素可促进细胞凋亡率增加，降低Wnt3a.-catenin和Bcl-2蛋白表达水平，升高Bax蛋白表达水平，差异具有统计学意义(P<0.05)°结论高良姜素可以抑制肺癌H1299细胞增殖并促进细胞凋亡，其机制可能与促进Bax的蛋白表达和抑制Wnt3a、-catenin和Bcl-2的蛋白表达有关。【关键词】高良姜素；H1299肺癌细胞；细胞凋亡StudyontheinhibitoryeffectofgalanginonlungcancercellH1299anditsmechanism.LIAOXiu-Shan.DepartmentofLahoratoiyMedicine,HainanBoaoYilingLifeCareCenter,Qionghai571400,Hainan,China!AbstractObjectiveToexploretheinhibitoryeffectofgalanginonlungcancercellH1299anditsmechanism.MethodsTheH1299cellsinthelogarithmicgrowthphasewereplatedina96-wellplate,treatedwithdifferentconcentrationsofgalangin(0,2.5,5,10,20,40,80molL)for24h,andMTTwasusedtodetectgalangalcalculatethehalfinhibitoryconcentration(IC50)ofH1299cellproliferation,andtake0,1/2,1/4,1/8IC50(0,25,12.5,6.25molL)intohigh,medium,andlowthedoseofgalanginwasusedforfollow-upexperiments,andtheapoptosisrateofH1299cellsandtheproteinexpressionofWnt3a,-catenin,Bax,andBcl-2weredetectedbyflowcytometryandwesternblotting.ResultsComparedwiththecontrolgroup,580molLgalangincellscansignificantlyinhibittheproliferationoflungcancercellH1299cells(P<0.05);calculatedbythefittingcurvemethod,galangin/Cso=5OmolL.0molLgalangincellapoptosisrate,Wnt3a,-catenin,BaxandBcl-2proteinexpressionlevelswere(4.23±0.45)%,(1.77±0.07),(2.51±0.15),(0.56±0.09),(1.89±0.12),6.25molLgalangincellapoptosisrate,Wnt3a,-catenin,BaxandBcl-2proteinexpressionlevelswere(9.02±1.01)%,(0.97±0.11),(0.99±0.05),(0.89±0.04),(1.21±0.09),12.5molLgalangincellapoptosisrate,Wnt3a,-catenin,BaxandBcl-2proteinexpressionlevelswere(18.48±2.33)%,(0.56±0.07),(0.88±0.11),(1.21±0.11),(0.88±0.10),25molLgalangincellapoptosisrate,Wnt3a,-catenin,BaxandBcl-2proteinTheexpressionlevelswere(26.44±1.17)%,(0.31±0.04),(0.43±0.05),(1.79±0.21),(0.28±0.07).Comparedwiththecontrolgroup,thelow,mediumandhighdosesofAlpiniagingerItcanpromotetheincreaseofcellapoptosisrate,reducetheexpressionlevelofWnt3a,-cateninandBcl-2protein,andincreasetheexpressionlevelofBaxprotein.Thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).ConclusionGalangincaninhibittheproliferationoflungcancerH1299cellsandpromotecellapoptosis.ThemechanismmayberelatedtopromotingtheproteinexpressionofBaxandinhibitingtheproteinexpressionofWn-cateninandBcl-2.KeyWordsGalangin；H1299lungcancercells；Apoptosis高良姜素即4H-I-苯并毗喃-4-1,3,5,7-三羟基-2-苯基或3,5,7-三羟基黄酮是天然存在于姜科山姜属植物的一种多酚化合物。众所周知，高良姜素在中医药治疗中主要用于抗诱变和抗病毒作用。多项研究发现，高良姜素具有抗氧化、抗炎、抗心肌缺血等生物学功能。近年来研究发现，高良姜素具有抗肿瘤活性和抑制癌细胞生长。高良姜素对多种类型的癌症具有较强的抑制作用，包括大肠癌、肝癌、胃癌等因此，深入研究高良姜素的抗肿瘤作用机制，对于防止肿瘤的发生发展具有重要意义。然而，关于高良姜素抗肺癌的机制尚未明确。本研究旨在观察高良姜素在人肺癌H1299中的作用，并探讨其可能的作用机制。1材料与方法1.1 主要材料肺癌H1299细胞株（中科院上海细胞库），高良姜素（上海纯优生物科技有限公司），Wnt3aP-Catenin、Bax、Bcl-2和GAPDH（美国CST公司），辣根过氧化酶标记二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），1640高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白前（美国GibCo公司），MTT试剂盒、AnneXinV-碘化丙咤（PI）细胞凋亡试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司），流式细胞仪（美国BD公司）,蛋白电泳仪、转膜槽、凝胶成像系统（美国BioRad公司）。1.2 细胞培养将含有10%FBS的RPMI1640培养基加入H1299细胞中，在37、5%CO2条件下培养。常规传代培养，取对数生长期细胞状态良好进行后续实验。1.3 MTT法检测细胞增殖能力取对数生长期H1299细胞按照4x103/孔密度接种于96孔板中，将高良姜素以2.5、5、10、20、40、80molL的浓度梯度对H1299细胞进行干预，溶剂对照组加等体积的0.1%DMSO,同时在空白对照组中不加细胞只加培养液（4孔/组），干预时间为24h。采用MTT试剂盒法检测细胞存活率并计算IC50,实验重复三次。细胞存活率实脸组OD值一个臼对照组OD伯100»对照组OD值一空白对照组OD值X,01.4 流式细胞术检测肺癌H1299细胞凋亡率根据细胞增殖实验结果，加入0、6.25、12.5、25moIL（对照组、低剂量、中剂量和高剂量组）的高良姜素处理H1299细胞24h。将各组细胞，消化、离心后收集细胞，PBS清洗3次后加入500LBindingbuffer重悬细胞，并加入5LAnnexinV和Pl轻轻混匀，避光孵育15min,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.5 WeStemblot检测肺癌H1299细胞中Wnt3a、-catenin>BaX和Bcl-2蛋白表达水平将细胞均匀铺于6孔板中，待细胞贴壁，观察细胞融合度，当细胞融合度达到8090%时，加入对照组、低剂量、中剂量和高剂量组的高良姜素处理H1299细胞24h后收集细胞总蛋白，采用BCA试剂盒法测定蛋白浓度。取30g蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,湿转，5%BSA室温封闭1h,加入一抗Wnt3a（1：1000）、-catenin（1：1000）、Bax（1：IooO）和Bcl-2（1：1000）4孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10分钟，加入二抗（1：5000）室温孵育2h,TBST洗膜3次，每次15分钟，利用化学发光液显影。采用ImageJ软件进行分析，以目的蛋白/内参蛋白（GAPDH）的灰度值作为蛋白的相对表达量。1.6 统计学方法采用SPSSl9.0统计软件分析本研究中数据。符合正态分布的计量资料以平均值土标准差表示，组内比较采用配对r检验，多组间比较采用单因素方差分析并使用LSD-r法进行多重比较，不符合参数检验的数据比较采用秩和检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1 MTT检测不同浓度高良姜素对H1299细胞的生长抑制作用2.1.1 不同浓度高良姜素对H1299细胞的生长抑制作用不同浓度的高良姜素作用于肺癌H1299细胞24h后，高良姜素均可以抑制H1299细胞增殖（P<0.05）,且随着剂量的增加，抑制增殖作用越强；同时，高良姜素对肺癌H1299细胞的半数抑制浓度为50molL0选取0、25、12.5、6.25molL高良姜素进行后续实验。见表1。表1不同浓度的高良姜素对H1299细胞存活率的影响Concentration(molL)Survivalrate(%,x±s
