趋化因子CXCL13对血脑屏障通透性的影响及临床意义.docx

趋化因子CXCL13对血脑屏障通透性的影响及临床意义章俏雷，方炳木*,江锦红，汪笑秋，刘永华，王晓丽，曾玉晓，兰义芬温州医科大学附属医院，丽水市人民医院血液科，浙江丽水323000摘要目的探讨研究趋化因子CXCiJ3对血脑屏障通透性的影响，从而探讨CXCLI3改变血脑屏障通透性的内在机制。方法实验分为对照组，CXCLI3组，CXCR5敲除组，内皮细胞经不同浓度CXCLI3及CXCR5敲除预处理48h后，免疫印迹法检测细胞内E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白表达水平，血脑屏障跨膜电阻检测跨膜电阻、渗漏实验检测FlTC荧光强度。结果与对照组相比，CXCLI3组细胞间质型相关蛋白N-钙黏蛋白升高，前神经型相关蛋白E-钙黏蛋白表达水平降低，血脑屏障跨膜电阻（213.68Qcm2）小于对照组，通透性（荧光值3.ugML）大于对照组（P均0.05）；给予CXCR5特异基因敲除试剂盒处理后，与CXCLI3组相比细胞，细胞N-钙黏蛋白表达显著下降，E-钙黏蛋白表达显著升高，血脑屏障跨膜电阻（590.2lcm2）大于对照组，通透性（荧光值0.ug/ML）小于对照组（P均V0.05）。结论CXCLI3通过结合CXCR5调节N-钙黏蛋白表和E-钙黏蛋白的表达，改变血脑屏障通透性。关键词CXCL13；E-钙黏蛋白；N-钙黏蛋白；血脑屏障；通透性EffectofchemokineCXCL13onbloodbrainbarrierpermeability.ZHANGQiao-lei,FANGBitIgTnu*,JIANGJin-hong,WANGXiao-qiu,LIUYong-hua,WANGXiao-Ii,ZENGYu-xiao,LANYi-fen.DepartmentofHematology,AffiliatalHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Peoples,HospitalofLishui,Zhejiang323000,China.AbstractObjectiveToinvestigatetheeffectofchemokineCXCL13onblood-brainbarrierpermeability,andtoexploretheinternalmechanismofCXCL13changingblood-brainbarrierpermeability.MethodsTheexperimentwasdividedintocontrolgroup,CXCL13groupandCXCR5knockoutgroup.EndothelialcellswerepretreatedwithdifferentconcentrationsofCXCL13andCXCR5for48hours.TheexpressionlevelsofE-cadherinandN-cadherininendothelialcellsweredetectedbyWesternblotting.Thepermeabilityofbld-brainbarrierwasanalyzedbyleakagetestandtransmembraneresistancetest.Eachexperimentwasrepeatedthreetimesindependently.ResultsComparedwiththecontrolgroup,intracellularN-cadherinandE-cadherinexpressioninCXCL13groupwerehigherthanthoseincontrolgroup(P<0.05)AftertreatmentwithCXCR5specificgeneknockoutkit,comparedwiththeCXCLl3group,theexpressionofN-cadherinwasdecreased,theexpressionofE-cadherinwasincreased(P<0.05),andthetransmembraneresistanceofblood-brainbarrierwasincreased,andthepermeabilitywasdecreased.ConclusionCXCLl3regulatestheexpressionofN-cadherinandE-cadherinthroughbindingwithCXCR5,andchangesthepermeabilityofblood-brainbarrier.KeywordsCXCLl3;E-cadherin;N-cadherin;Bloodbrainbarrier;Permeability中枢神经系统白血病(Centralnervoussystemleukemia,CNSD是白血病细胞对中枢神经系统的直接浸润，任何型的白血病均有可能并发CNSIJL2叫因为化疗药物难以透过血脑屏障进入脑脊液循环，达不到治疗要求的血药浓度，因此CNSL是白血病髓外浸润及复发的主要原因1458。CNSL仍是影响急性白血病患者预后的重要因素叫白血病细胞浸润中枢的主要机制是透过血脑屏障进入中枢。血脑屏障（Bloodbrainbarrier,BBB）是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，这些屏障能够阻止病原生物和其他大分子物质由血液进入脑组织。CXCL13（C-X-CmotifChemokine13）是CXC趋化因子家族成员之一，属多次跨膜结构的G蛋白1期。CXCR5（C-X-CChemokinereceptortype5）是CXCL13的受体,与GTP2蛋白耦联构成跨膜受体。研究发现脑脊液和血液的高浓度CXCLl3与高白细胞血症之间呈正相关性W，而高白细胞血症是发生中枢神经系统白血病的危险因素I。外周血液循环中的CXCL13可以透过血脑屏障进入脑组织，参与中枢神经系统的炎症过程U4儿但是，CXCL13改变血脑屏障通透性的机制尚不完全清楚，本研究拟观察CXCL13对内皮细胞的影响，探讨CXCLI3改变血脑屏障通透性的机制。1材料与方法1.1 一般材料人脑星形胶质贴壁细胞（Becker,美国ATCC公司）、人脑微血管内皮细胞（HBMEC,美国SCienCeIl公司）、CXCLI3（惠诚生物公司）、CXCR5特异基因敲除试剂盒（美国Epigentek公司）、DMEM（Hydone公司）、胎牛血清（GIBCO公司）、E-Cadherin、N-Cadherin（AbCam公司）、GAPDH（CST公司）、青链霉素混合液、胰蛋白酶-EDTA消化液（SOlarbiO公司）、FITC-DEAE-Dextran（Sigma公司）、Transwell小室（美国CorningIncorporated公司）。1.2 方法1.2.1 CXCLI3最佳作用浓度选择取对数生长期的细胞，冷PBS洗涤细胞2遍，加入0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTAI:1混合液消化重悬，接种于6孔板，补足培养基至2mL,培养箱中观察（37、5%C02）o根据CXCLI3不同浓度（0、10、20、50ng/mL）分组，培养48小时后收集各组细胞；预冷PBS清洗，加入蛋白裂解液，煮沸10分钟（100cC）,离心IOmin（4,12000×g）。每孔20g蛋白样品上样，电泳，行10%变性SDS-PAGE。将蛋白转移至PVDF膜，加入5%牛血清白蛋白封闭30min。加入一抗，TBST洗膜3次。加入二抗，TBST洗膜3次，显色曝光，蛋白相对表达水平为目的条带灰度值与内参条带灰度值的比值。一抗N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白稀释比均为1：1000、一抗OLIG2的稀释比为1：500,二抗稀释比均为1：10000。根据蛋白表达量选择CXCLJ3最佳作用浓度。.1.2.2 内皮细胞E-钙蛋白、N-钙Ite蛋白的检测将细胞分为对照组（HBMEC+Becker）,CXCLI3组（HBMEC+Becker+CXCL13）,CXCR5敲除组（HBMEC+Becker+CXCLI3+CXCR5敲除试剂）。预处理48小时后收集各组细胞；预冷PBS清洗，加入蛋白裂解液，煮沸】0分钟（Io（TC）,离心IOmin（4,12000×g）0每孔20g蛋白样品上样，电泳，行10%变性SDS-PAGE。将蛋白转移至PVDF膜，加入5%牛血清白蛋白封闭30min。加入一抗，TBST洗膜3次。加入二抗，TBST洗膜3次，显色曝光，蛋白相对表达水平为目的条带灰度值与内参条带灰度值的比值。一抗N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白稀释比均为1：1000、一抗OLIG2的稀释比为1：500,二抗稀释比均为1：10000c每组实验独立重兔3次。1.2.3 血脑屏障跨膜电阻检测将细胞分为对照组（HBMEC+Becker）,CXCLI3组（HBMEC+Becker+CXCLI3）,CXCR5敲除组（HBMEC+Becker+CXCL13+CXCR5敲除试剂）。培养液含10%胎牛血清、1%双抗（青链霉素混合液）DMEM,培养箱中培养（37、5%CO2）O显微镜下观察细胞为贴壁细胞。取IxlO4个BeCker细胞，接种于24孔TranSWeH板的板底，培养4小时，待细胞长至80%融合时，取HBMEC细胞接种于小室上侧，调整密度为2X105cm2,培养箱中培养（7°C、5%Co2）。CXCLl3组小室上侧加入CXCLl3（50ngml）,CXCR5敲除组小室上侧加入CXCLI3（50ngml）和CXCR5敲除试剂,测跨膜电阻。1.2 .4血脑屏障通透性检测（FITCYeXtraro将细胞分为对照组（HBMEC+Becker）,CXCL13组（HBMEC+Becker+CXCL13）,CXCR5敲除组（HBMEC+Becker+CXCL13+CXCR5敲除试剂）。取1x104个Becker细胞接种于24孔Transwell板，培养4h,再置于24孔板内培养，细胞长至80%融合时，HBMEC细胞接种于小室上侧，调整密度为2X105cm2,培养箱中培养（37°C、5%CO2）细胞培养至汇满，根据实验分组予相应处理，之后加入lmgmlFITC-dextran,培养箱中培养5分钟（37、5%CO2）,吸取200l基底端培养基作为基础值，并补足培养基，继续孵育24h。吸取200l基底端培养基，以酶标仪检测FrrC荧光强度（激发波长490nm,发射波长520nm）,计算通透率。1.3 统计学分析实验数据应用GraPhPadPriSm6.0统计软件进行分析。所有数据采用i±s表示，两组间比较采用t检验，组间差异采用Log-rank检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1 CXCLI3最佳作用浓度的选择结果显示，不同浓度CXCLI3（0、10、20、50ng/mL）预处理后，与Ong/mL相比，50ngmLCXCL13处理后细胞内E-钙黏蛋白（P<0.05）的表达显著降低，N-钙黏蛋白（P<0.05）的表达显著增高，GAPDH差异无统计学意义。选择50ngmLCXCLl3作为最佳实验浓度进行后续实验。见图1。图1.小卜，昧度CXCLl3对内皮1»的比日FQ1EfVeCtSofddferontconcentrationsofCXCL13OfiOndOthoIialcellrlatdprotin*2.2 CXCLI3对E-钙½蛋白、N-钙½蛋白的影响与对照组相比，50ngmLCXCL13处理后，CXCLI3组内皮细胞内E-钙黏蛋白的表达降低（P<0.05）,N-钙黏蛋白的表达增高（P<0.05）与CXCLJ3组相比，CXCR5敲除组E-钙黏蛋白的表达增高（P<0.05）,N