还原型谷胱甘肽reducedglutathione,GSH试剂盒说明书.docx

还原型谷胱甘肽（reducedglutathione,GSH）试剂盒说明书微量法100T/96S注意8正式测定之前选择23个预期差异大的样本做预测定。澜定意义：GSH是细胞内最主要的抗氧化硫基物质，在抗氧化、蛋白质疏基保护和氨基酸跨膜运输等中具有重要作用。还原型与氧化型比值（GSHGSSG）是细胞氧化还原状态的主要动态指标。因此，测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。渊定原理：DTNB与GSH反应生成复合物，在412nm处有特征吸收峰：其吸光度与GSH含量成正比。自备仪器和用品：低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/醉标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸储水。试剂组成和配制：试剂一：液体Xl瓶，4tC保存。试剂二：液体Xl瓶，4C保存。试剂三：液体Xl瓶，42避光保存。粗液提取：1 .组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：510的比例（建议称取约0.1g组织，加入ImL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g,4离心IOmin,取上清置冰上待测。2 .细菌、真菌：按照细胞数量（IO4个）：试剂一体积（mL）为5001000:1的比例（建议500万细胞加入ImL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g,4,离心IOmin,取上清置于冰上待测。3 .血清等液体：直接测定。GSH测定操作：1 .分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到412nm,蒸储水调零。2 .试剂二置于25（一般物种）或者37tC（哺乳动物）水浴中保温30min°3 .空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20L蒸储水，140L试剂二，40L试剂三，混匀静置2min后测定412nm吸光度Al。4 .测定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20L上清液，140L试剂二，40L试剂三，混匀价置2min后测定412nm吸光度A2。注意I空白管只需要测定一次。GSH含计算公式：GSH标准曲线公式：y=1.5x（x为GSH浓度，molmL;y为吸光值），.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下（1）按蛋白浓度计算GSH(molmgprot)=(A2A1)÷1.5×V样÷(V样XCPr)=O.667×(A2-A1)÷Cpr(2)按样本质量计算GSH(molg鲜重)=(A2-A1)÷1.5xV样÷(V样÷V样总XW)=O.667x(A2-Al)÷W(3)按细胞数量计算GSH(mol104cell)=(A2-A1)÷1.5xV样÷(V样÷V样总X细胞数量尸0.667x(A2-Al)÷细胞数量(4)按液体体积计算GSH(molmL)=(A2-A1)÷1.5xV样÷V样=O.667×(A2-A1)V反总：反应总体积，0.2mL；V样总：上清液总体枳，1mL；V样：加入反应体系中上清液体积，20L=0.02mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量b.使用96孔板测定的计算公式如下GSH标准曲线公式：y=0.75x(X为GSH浓度，mol/mL;y为吸光值)(1)按蛋白浓度计算GSH(molmgprot)=(A2-A1)÷O.75xV样÷V样÷Cpr=1.334x(A2-Al)÷Cpr(2)按样本鲜重计算GSH(molg鲜而)=(A2Al)÷0.75xV样÷(V样÷V样总XW)=I.334x(A2-Al)÷W(3)按细胞数量计算GSH(mol104cell)=(A2-A1)÷.75×V样÷(V样÷V样总X细胞数量)=1.334x(A2Al)÷细胞数量(4)按液体体积计算GSH(molmL)=(A2-A1)÷O.75xV反总÷V样=1.334×(A2-A1)V样总：上清液总体积，1mL；V样：加入反应体系中上清液体积，20L=0.02mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL：W：样品质量，go注意事项：1 .试剂一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。2 .最低检出限为0.01ImmOI/L。优剁科(上海)生的科学*11«L.X