2023欧洲疾病预防控制中心《百日咳鲍特菌的实验室诊断和分子监测》解读.docx

2023欧洲疾病预防控制中心百日咳鲍特菌的实验室诊断和分子监测解读摘要百日咳是一种极具传染性的急性呼吸道感染性疾病，尽管已广泛开展了儿童疫苗接种，但并不能由此获得终身免疫。为应对百日咳在世界流行的挑战，2022年12月21日欧洲疾病预防控制中心发布了百日咳鲍特菌的实验室诊断和分子监测，详细描述了百日咳实验室诊断和分子监测的方案，值得我国从事百日咳诊疗的医护人员和技术人员研究学习，现介绍并解读该文件的主要内容。关键词百日咳鲍特菌；实验室诊断；分子监测百日咳是由百日咳鲍特菌(8ode/aPe""ss/M)引起的具有高度传染性的呼吸道疾病,全年龄段人群均可感染发病。自20世纪50年代起，随着百日咳疫苗的广泛接种，百日咳发病率显著降低，但近年来，一些疫苗接种率较高的国家和地区相继报道百日咳发病率逐渐上升，称为百日咳再现【1。但国家之间监测的百日咳流行病学变化特征并不一致，不同国家推广的百日咳检测方法和应用策略存在显著差异21,削弱了百日咳发病数据之间的可比性。2022年12月21日欧洲疾病预防控制中心(EuropeanCentreforDiseasePreventionandControl,ECDC)发布了百日咳鲍特菌的实验室诊断和分子监测3),不仅详细描述了百日咳实验室诊断，包括细菌培养、核酸检测、抗原鉴别以及血清鉴定的方法，而且对相关的分子监测，如抗原序列分析和基因组测序等方法加以阐述，值得我国从事百日咳诊疗的医护人员和技术人员研究学习，本文介绍并解读该文件的主要内容。1标本的采集与转运百日咳鲍特菌主要在人的鼻咽部生长繁殖，可从鼻咽拭子(nasopharyngealSWab,NPS)或鼻咽抽吸物(nasopharyngealaspirate,NPA)标本中分离。NPA是临床上常见的呼吸道感染病原体检测标本，且可分成等份并保存，易于多个研究共享，但收集以门诊就诊为主的年长儿、青少年和成人的NPA标本较难，因此除了婴幼儿住院患者，NPS更易于采集。止匕外，由于需要患儿及其家属更长时间的配合，临床上采集到合格的NPA标本更为困难，相对而言，NPS采样更加方便快捷，接受度更高。因此，作者所在团队2000年以来，一直采用NPS进行百日咳鲍特菌分离培养和核酸检测。NPS采样技术在新型冠状病毒病疫情期间也得到了推广和普及。用于百日咳鲍特菌分离培养和特异核酸检测标本最佳的采集时间为咳嗽出现后的3周内ML世界卫生组织推荐咳嗽病程1个月内适宜百日咳病原学诊断【5】。如有可能，室温下采集的拭子应立即接种，如需转运，4h内运送到微生物实验室进行培养；如置于含有木炭的ReaganLowe(RL)、Amies培养基中或通用运输培养基中可适当放宽转运时间。建议高温季节时采用冰盒转运。2实验室诊断2.1细菌培养与成人相比，儿童(尤其是婴儿)患者的NPS中百日咳鲍特菌DNA含量更高，因此，百日咳婴幼儿一般采用细菌培养或核酸扩增的方法辅助诊断。对咳嗽持续时间<21d的百日咳疑似病例采集NPS,并划线接种到补充有15%去纤维蛋白绵羊血或马血的新鲜RL或鲍-金培养基(Bordet-Gengoumedium,BG)±,RL和BG平板上的百日咳分离率相似。BG的主要优点是观察溶血更为方便。由于百日咳鲍特菌为苛养型革兰阴性球杆菌，且生长速度慢，因此通常要加入选择性培养基添加物-头抱氨节以抑制其他细菌的生长。接种标本的平板应置于35-36有氧条件下培养7d,并每天检视,3d后若见灰白色、圆形、半透明水银滴样的细小疑似菌落，可以采用特异性血清凝集试验或聚合酶链反应(PCR)加以鉴定，也可以借助基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行确认。过夜培养就可见的疑似菌落可能是副百日咳鲍特菌，也应进行鉴定确认。培养7d后没有可疑菌落生长的平板可以培养阴性处理。为避免平板干燥，孵箱内需保持湿度在60%左右。传统的细菌培养，虽然检测特异度高，也可以用于评估其抗生素的耐药性，但由于操作的复杂性，结果容易受到标本的采取手法，实验室的培养条件等因素的影响，其阳性检出率低。2.2核酸检测核酸检测受抗生素使用的影响较细菌培养小，咳嗽病程短于4周(<28d)的疑似病例尤其是尚处于发病初期的百日咳病例，可以通过核酸检测进行诊断。对于病程已超过1个月，但不能排除仍具有传染性的患者，仍可考虑进行核酸检测。李玥等16J以百日咳临床诊断为评估标准，发现核酸检测法的灵敏度为细菌培养法的19倍，但特异度不及细菌培养法。其他研究结果也有类似发现7-8。2.2.1PCR由于检测灵敏度与发病到样本采集之间的时间成反比,ECDC建议在症状出现后尽快进行标本采集，最好在发病后21d内采集。通过PCR诊断百日咳在婴幼儿中特别有用，因为他们大多在感染早期就诊。PCR可以对不同鲍特菌感染进行鉴别诊断。诊断时应用较多的鲍特菌目的基因序列主要是重复插入序列(insertionsequences,IS),尤其是IS481和ISIOC)1。IS481存在于百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌和一些支气管脓毒鲍特菌分离株中，ISIoOl存在于副百日咳鲍特菌和一些支气管脓毒鲍特菌分离株中。IS元件以高拷贝数存在于基因组中，从而增加了检测灵敏度。仅以IS481阳性确定为百日咳鲍特菌感染，或以IS1001阳性确认为副百日咳鲍特菌感染的诊断标准是不正确的。为了同时获得较高的灵敏度和特异性，推荐与其他靶基因，如PT基因启动子(PertUSSiStoxinpromoter,ptxP),或在霍氏鲍特菌中存在的类IS1001序列(hIS1001)结合使用，即基于IS481xIS1001xIS1002和hIS1001的多重PCR来区分百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌和霍氏鲍特菌等。本课题组自2013年以来，共采集8168例可疑百日咳患儿的NPS,仅分离到副百日咳鲍特菌15例；近期采用多重PCR方法检测2018年以来细菌培养阴性的NPS共4321例，副百日咳鲍特菌阳性4例，未检出霍氏鲍特菌；提示当前国内儿童人群副百日咳鲍特菌流行程度很低，还未发现存在霍氏鲍特菌感染。但检测对象的范围(如主要是婴幼儿标本，年长儿和成人标本较少；主要是华北、东北地区的患者，其他地区患者较少)有限，还需更多研究。222环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplificationfLAMP)LAMP作为新型核酸扩增技术已开始商品化，凭借无需复杂的热循环装置和昂贵的试剂，可在恒温条件下特异、快速地扩增DNA,可作为PCR替代品高效地检测百日咳鲍特菌，广泛应用于缺乏实验室技术条件的基层。据最新报道91,一种新型uvrD_2LAMP检测方法对检测鼻咽拭子中的百日咳鲍特菌DNA具有高度敏感性和特异性,其诊断性能不亚于复杂且高成本的多靶点qPCR,但其更快、更简单且更便宜。2.3抗原检测侧流免疫分析(Iateralflowimmunoa-ssays,LFIA)针对血液中的抗体或鼻咽中的百日咳鲍特菌抗原，通过将样品添加到吸收性样品垫上，测试使用液相色谱，结果可以类似于新型冠状病毒肺炎侧流法(lateralflow,LF)的方式进行解释,其中阳性测试将在设备上显示为双线(对照线和测试线)。在Salminen等1。研究中，分别将LF与常规的酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunoassay,ELISA)方法用来检测170株疑似百日咳样本，得出二者的检测的总体一致性为157/170(92%),LF的敏感性和特异性分别高达88%(63/72)和96%(94/98)o此外，Knuutila等【”1将LF与口腔流体ELISA进行对比，也得出相似的结论。LF可以作为一种易于执行的方法来替代ELISA检测方法，用于诊断和监测百日咳，尤其在实验条件不足和资源匮乏的国家。但从采样到获得结果的时间较长，还需要进一步优化。目前这种LF分析尚未进行商业化。目前百日咳的即时检测(point-of-caretesting,POCT)主要包括LAMP和LF方法，其他的POCT方法仍处于研发过程。2.4血清学诊断对于咳嗽病程不到2周的患者，可能由于患百日咳的时间比较短，尚未形成足够量的抗体，导致血清学阳性率较低。但如果患者咳嗽了23周或更长时间，ECDC建议通过血清学方法检测抗PT-IgG水平进行诊断最有效，尤其对于就诊时间常常较晚的年长儿、青少年和成人更为适用。百日咳鲍特菌可表达多种毒力因子，其中百日咳毒素(PertUSSiStOXin,PT)是其特有毒力因子,测定血清中PT-IgG抗体的浓度是血清学检测的目标，一般采用ELISA或多重免疫测定(multipleximmunoassays,MlA)法。一般而言,100IUmL或125IU/mL的PT-IgG抗体的浓度可作为1年内近期感染的临界值,50100IU/mL可作为过去几年内感染的临界值。丹麦、荷兰和英国等研究表明，诊断百日咳现症感染要获得最佳灵敏度和特异度，抗PT-IgG单次临界值在60ImL和75ImL之间门L用于检测的血清或血浆最好在4h内进行快速分离应在室温下保存；需延迟检测的样品，则放入冰柜(2-8)冷藏，如需要长期储存，样品应该在-20。C以下或更低温度下冷冻。此外，由于口腔流体拭子(oralfluidswabs)较血液采集更为容易，市面上已出现可用于口腔流体取样的试剂盒，只需要棉签沿着牙龈线摩擦12min收集液体即可进行百日咳诊断。Litt等I'用口腔流液ELlSA检测血清阳性样本的灵敏度为79.7%,特异度高达96.6%,可作为一种无创检测方法替代ELISA,也更容易为儿童和监护人所接受，成本也更低。3百日咳鲍特菌分离株的流行病学研究方法3.1血清分型菌毛(fimbriae,Fim雇百日咳鲍特菌表面的一种丝状蛋白，Fim2和Fim3作为主要亚基，其表达水平决定了百日咳鲍特菌分离株的血清型，由此血清型可以分为Fim2、Fim3或Fim2,3"5)。一般采用玻片凝集方法，将已培养2448h的细菌与特定血清分型抗血清或单克隆抗体在载玻片上混合，轻轻摇动载玻片，在30s内观察是否发生凝集。也可使用微量凝集和间接ELISA方法。细菌凝集方法适用于少量分离株,而ELISA方案更适合一次性处理大量分离株。如有可能，建议使用单克隆抗体对百日咳鲍特菌进行血清分型。3.2抗菌药物敏感试验大环内酯类是治疗百日咳鲍特菌感染的一线药物。尽管美国首先报道了耐红霉素百日咳鲍特菌【16】，但当前国外耐药菌株并不多见，而近年来国内大环内酯类耐药百日咳鲍特菌呈广泛流行。上海地区分离株对红霉素等大环内酯类耐药比例为57.5%"J,北京地区高达91.9%18。大环内酯类耐药百日咳鲍特菌分离株也已在邻国(日本和越南)出现【19-20。在上述研究中，采用药敏检测方法包括E-test纸条法和纸片扩散法分别测量最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration,MlC)以及纸片抑菌直径，所有耐药菌株红霉素MIC>256mg/L或纸片抑菌直径<35mm0大环内酯类耐药机制是百日咳鲍特菌23SrRNA基因结构域V中2047位(A2047G)核昔酸A改变为G的点突变。3.3脉冲场凝胶电泳2000年，百日咳领域的专家基于XbaI和SPel两种酶建立了百日咳鲍特菌的脉冲场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)的参考方法211,用来分析分子大小在23和500kb之间的条带，具体信息可以参考网站：http:/www.pasteur.fr/recherche/unites/Bordetella/Analysis.html一项2012年至2015年的研究在欧洲百日咳鲍特菌中发现了PFGE谱型发生明显变化，BpSR3(29.4%)和BPSRIo(27.2%)变得普遍，而以前占主导地位的BpSR11和其他谱的数量和占比下降22。PFG