流式细胞仪原理.ppt
流式细胞仪原理与应用流式细胞仪原理与应用提提 要要n流式细胞仪简介流式细胞仪简介n流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理n流式实验流程流式实验流程n流式细胞术的应用流式细胞术的应用流式细胞术的发展史流式细胞术的发展史n1930s1950s:1930s1950s:开始出现自动细胞分析技术（细开始出现自动细胞分析技术（细胞的计数，是通过光电仪记录流过一根毛细管胞的计数，是通过光电仪记录流过一根毛细管的细胞的细胞,用结合了荧光素的抗体去标记细胞内用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动计数器。）红细胞光学自动计数器。）n1960s1960s晚期发展：荧光检测细胞计晚期发展：荧光检测细胞计 、细胞分选、细胞分选器检测细胞的荧光信号器检测细胞的荧光信号 、单克隆抗体技术、单克隆抗体技术 n19731973年，年，BDBD公司与美国斯坦福大学合作，研制公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS FACS I I。什么是流式细胞仪？什么是流式细胞仪？n在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器n仪器特点：单个细胞通过狭窄激光束，产生能够反映细胞仪器特点：单个细胞通过狭窄激光束，产生能够反映细胞大小的信号，激光束激发不同的荧光素所标记的细胞成分大小的信号，激光束激发不同的荧光素所标记的细胞成分能发射出不同的荧光。能发射出不同的荧光。Injector TipSheath fluid流式细胞仪的检测对象流式细胞仪的检测对象藻类细胞藻类细胞染色体染色体血细胞血细胞原生动物细胞原生动物细胞任何存在于悬液中的直径为任何存在于悬液中的直径为0.2-50微米微米的粒子或细胞都适用于流式分析的粒子或细胞都适用于流式分析流式细胞仪工作原理示意图流式细胞仪工作原理示意图流式的基本组流式的基本组成：成：1.流动室和流动室和 液流系统液流系统2.光路系统光路系统3.电系统电系统流式细胞仪可提供的信息流式细胞仪可提供的信息n物理信息：通过散射光信号反映物理信息：通过散射光信号反映n相对细胞大小相对细胞大小n相对细胞颗粒密度和内部复杂度相对细胞颗粒密度和内部复杂度n荧光信息：通过荧光强度反映荧光信息：通过荧光强度反映 散射光信号的产生散射光信号的产生n488nm激光产生散射光激光产生散射光1.散射光信号散射光信号n前向角散射光（前向角散射光（FSC,Forward Scatter）入射激光的入射激光的同向同向散射光信号散射光信号 反映细胞相对反映细胞相对大小及其表面积大小及其表面积n侧向角散射光（侧向角散射光（SSC,Side Scatter）入射激光入射激光90 角角的的散射光信号散射光信号 反映细胞反映细胞粒度及细胞内相对复杂性粒度及细胞内相对复杂性 散射光散射光n散射光能被用来区分不同细胞群体的基散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异本形态上的差异n通常使用通常使用“散点图散点图”来看散射光信号来看散射光信号n散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据的数据 利用散射光信号对混合细胞分群利用散射光信号对混合细胞分群2.荧光信号荧光信号n荧光素与特异抗体结合荧光素与特异抗体结合n荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强荧光信号越强荧光信号的表示方法荧光信号的表示方法双参数点图双参数点图单参数直方图单参数直方图一个完整流式实验的组成一个完整流式实验的组成n样品的处理样品的处理n调整仪器条件调整仪器条件n数据处理数据处理1.样品处理样品处理n单细胞悬液的制备单细胞悬液的制备n浓度浓度5 5 10105 5 1 1 10106 6/mL/mLn外周血、骨髓、培养细胞、组织外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网经尼龙网300300目目过过滤滤)制成单细胞悬液制成单细胞悬液n选择合适的荧光染料染色选择合适的荧光染料染色n必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发n激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内围内n荧光素光谱的重叠应当尽量减少荧光素光谱的重叠应当尽量减少2.仪器条件的确定仪器条件的确定n电压电压n阈值阈值n荧光补偿（多色分析）荧光补偿（多色分析）n处在液流中的粒子通过激光束时产生光信号，这些处在液流中的粒子通过激光束时产生光信号，这些光信号通过光电探测器转换成电信号（电压）。调光信号通过光电探测器转换成电信号（电压）。调整电压，可使信号强度改变。整电压，可使信号强度改变。nBDBD流式细胞仪有两种类型的光电探测器：光电二极流式细胞仪有两种类型的光电探测器：光电二极管和光电倍增管（管和光电倍增管（PMTsPMTs）。）。nPMTPMT用于检测较弱的用于检测较弱的SSCSSC信号和荧光信号信号和荧光信号 ，光电二，光电二极管用于检测较强的极管用于检测较强的FSCFSC信号信号 电压电压阈值阈值n阈值：阈值：信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。荧光补偿荧光补偿n采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差荧光补偿荧光补偿补偿调整的实验过程补偿调整的实验过程n样本准备：阴性样本，单阳性样本样本准备：阴性样本，单阳性样本n调整：第一步：阴性样本调整所有调整：第一步：阴性样本调整所有PMT 第二步：单阳性样本调整补偿第二步：单阳性样本调整补偿n判断标准：判断标准：补偿模型补偿模型PE-X%FITC补偿前补偿前补偿后补偿后FITC单染单染数据分析数据分析n设门设门n设定阴性与阳性群体的界限设定阴性与阳性群体的界限n确定阳性与阴性细胞群体确定阳性与阴性细胞群体n统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数均荧光值，绝对数或抗体结合数设门设门n设门的意义：选定要分析的目标细胞设门的意义：选定要分析的目标细胞设门设门如何设定阴性与阳性的界限如何设定阴性与阳性的界限流式检测结果的表示方法流式检测结果的表示方法n百分率百分率n绝对计数绝对计数n平均荧光强度平均荧光强度n图形：直方图、散点图图形：直方图、散点图流式细胞仪可以告诉我们什么？流式细胞仪可以告诉我们什么？流式细胞术的细胞学应用流式细胞术的细胞学应用细胞结构细胞结构n细胞大小细胞大小n细胞流式细胞术的细细胞流式细胞术的细胞学应用粒度胞学应用粒度n细胞表面面积细胞表面面积n核浆比例核浆比例nDNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期nRNARNA含量含量n蛋白质含量蛋白质含量n染色体分析染色体分析 细胞功能细胞功能n细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的核的特异性抗原特异性抗原n细胞活性细胞活性n细胞内细胞因子细胞内细胞因子n酶活性酶活性n激素结合位点激素结合位点n细胞受体细胞受体n细胞凋亡细胞凋亡流式细胞仪在微生物研究中的应用流式细胞仪在微生物研究中的应用nDNADNAn蛋白蛋白n过氧化物生成过氧化物生成n胞内胞内pHpHn鉴别死鉴别死/活细菌和酵母菌并计数活细菌和酵母菌并计数n区分革兰氏阳区分革兰氏阳/阴性细菌阴性细菌n研究酵母菌细胞器研究酵母菌细胞器n基因表达基因表达-绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白n病原菌与吞噬细胞的关系病原菌与吞噬细胞的关系-吞噬引起的呼吸爆发吞噬引起的呼吸爆发n病毒病毒-细胞相互作用：病毒感染导致细胞蛋白表达的改细胞相互作用：病毒感染导致细胞蛋白表达的改变，对细胞周期的干扰，对细胞内钙离子水平的影响变，对细胞周期的干扰，对细胞内钙离子水平的影响n病毒引起的凋亡病毒引起的凋亡流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用=HIVHIV免疫分型，免疫分型，CD4CD4绝对计数绝对计数=白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型=肿瘤的细胞周期和倍体分析肿瘤的细胞周期和倍体分析=网织红细胞计数网织红细胞计数=细胞移植的交叉配型和免疫状态监测细胞移植的交叉配型和免疫状态监测=干细胞计数干细胞计数=残量白血病细胞检查残量白血病细胞检查=HLA-B27HLA-B27检查检查=血小板功能及相关疾病血小板功能及相关疾病补偿调整实验补偿调整实验藻类细胞绝对计数藻类细胞绝对计数细胞周期分析细胞周期分析nDNADNA含量分析含量分析-PI-PI染色染色细胞凋亡细胞凋亡n细胞膜分析细胞膜分析-PS-PS外翻外翻 PSPS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表面，凋亡时，面，凋亡时，PSPS外翻向细胞外表面。重组蛋白外翻向细胞外表面。重组蛋白Annexin-VAnnexin-V可与可与PSPS结合结合细胞凋亡细胞凋亡细胞生理学研究细胞生理学研究nCaCa2+2+流动性检测流动性检测nCaCa2+2+是非常重要的细胞内离子，在胞膜到是非常重要的细胞内离子，在胞膜到胞浆的信号转导中起重要的作用。细胞受到胞浆的信号转导中起重要的作用。细胞受到刺激后，胞内刺激后，胞内CaCa2+2+浓度会发生改变。浓度会发生改变。n最常用的染料最常用的染料nIndo-1 excited at UVnFluo-3 excited at 488nmnFura red excited at 488nm细胞生理学研究细胞生理学研究n细胞活性分析细胞活性分析 Fluorescein DiacetateFluorescein Diacetate进入活细胞后进入活细胞后,被胞内被胞内酯酶降解酯酶降解,生成荧光底物生成荧光底物.活细胞会发绿色荧光活细胞会发绿色荧光细胞生理学研究细胞生理学研究n细胞膜电位的改变细胞膜电位的改变n超极化的细胞摄取更多的染料，细胞总的荧超极化的细胞摄取更多的染料，细胞总的荧光强度增大；细胞去极化时，染料释放到细光强度增大；细胞去极化时，染料释放到细胞外，总的荧光强度减少胞外，总的荧光强度减少。n染料和试剂染料和试剂nDiOC6(3)DiOC5(3)DiOC1(3)DiOC1(5)Valinomycin Gramicidin D CCCP细胞内标记细胞内标记 胞内多种肽类已被成功标记，包括病毒颗粒、胞内多种肽类已被成功标记，包括病毒颗粒、免疫球蛋白、雌激素受体、细胞因子、特殊蛋免疫球蛋白、雌激素受体、细胞因子、特殊蛋白如白如Bcl-2Bcl-2和和cyclooxygenase.cyclooxygenase.n胞内细胞因子胞内细胞因子n磷酸化蛋白磷酸化蛋白
