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第三章 流式细胞技术与流式细胞仪对比 流式细胞仪是一种特殊的显微镜 流式细胞仪 显微镜 流动的细胞 静止的细胞样本 数量大 数量少 高速分选 样本难以再利用细胞群体特征量分布 可以揭示细胞内部结构信息大家是否接触过流式细胞仪？它的主要作用是什么？FCM(Flow Cytometry)成为检验室中的CT，应该极广泛。70年代美国为攻克癌症而建造。厂商：Becton-DicksonCoulter-BeckmanDOCytomation 已成为一个几十亿美金的产业应用领域 疾病诊断生物学基础研究环境监测海洋微生物研究农业领域应用等等特点：光路调节系统固定自动化程度高操作简便使用寿命长配备1-2根激光细胞分选速度慢，主要用于细胞分析科研型FCM特点：分辨率高选配多种波长和类型激光器可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选和多色分析概述 流式细胞术的定义:应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞术。流式细胞仪的定义:流式细胞仪是以激光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。流式细胞仪的应用 生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等，所检测的生物颗粒的理化性质包括细胞大小、细胞形态、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白质含量、细胞膜完整性和酶活性等。免疫学、血液病变学等方面。流式细胞仪历史 1934年Moldavan 使悬浮的血红细胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来，这可谓流式细胞仪的最初模型。1965年Kamentsky用紫外吸收和可见光散射两个参数同时测量未染色的细胞，给出了细胞中核酸的含量和细胞大小，奠定了多参数流式细胞测量的基础。1967年Van Dilla 和Los Alamos采用了Crosland-Taylor设计的层流流动室和氩离子激光器开发出了液流束、照明光轴，检测系统三者互相垂直的流式细胞仪，成为目前各种流式细胞测量仪的基础。1969年Fulwyler利用Sweet的静电墨水喷射液滴偏转技术，建立了流式细胞分选术。Ehrlich和Wheeless利用飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨率的流式细胞仪变成了低分辨率的流式细胞仪。80年代以来，流式细胞仪的数据采集、存储、显示、分析日趋完善，随着样品制备方法的增多，新的荧光染料和细胞标记物的出现，流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。进入90年代，标本制备仪和自动进样器的问世，以及适合临床应用的单克隆抗体的增加，使流式细胞仪不仅出现在大专院校和科研单位，它也逐渐进入医院的中心实验室和检验科。一 流式细胞仪的工作原理一、生物学颗粒分析原理 1.样品的进入流动室：将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放人样品管。在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动。2.鞘液的作用：流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直相交，相交点称为测量区。鞘流技术问题：如果出现多个细胞同时经过检测区，会发生现象？怎么解决？细胞聚集：1、管路阻塞2、测量不准确3、速度降低4、光系统检测不精度鞘流技术：两种液体同轴流动，标本液位于轴心中心，鞘液在外层流动标本流：稳流鞘流：湍流Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid 3.信号的产生与接收：染色的细胞在测量区受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被光电倍增管和光电二极管接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得细胞的大小和核酸含量等指标。当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内。二 流式细胞仪的分类和基本结构一、流式细胞仪的分类二、流式细胞仪的基本结构（一）流动室与液流驱动系统（二）激光光源与光束成形系统（三）光学系统（四）信号检测与分析（五）细胞分选器 一、流式细胞仪的分类 流式细胞仪根据功能不同可分为临床型和科研型。临床型只有分析功能，没有分选功能，操作简便，易学易掌握。科研型既有分析功能又有分选功能，可快速将所感兴趣的细胞分选出来。一、流式细胞仪的分类流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。前者的光斑直径大于被检细胞体积，只能提供细胞内某种生物化学成分的参数。狭缝扫描流式细胞仪被检细胞直径大于激光光斑直径，可计算出细胞直径大小、核直径大小、核浆比例等一系列的形态学信息的定量资料。狭缝扫描流式细胞仪 被检细胞直径大于激光光斑直径，细胞通过光束时各部分被依次扫描。二、流式细胞仪的基本结构（一）流动室与液流驱动系统 流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。样品流在鞘流的环包下形成聚焦，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。流体动力学聚焦流动室激光聚焦液流与光源液流（二）激光光源与光束成形系统 激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照。由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1s左右，且细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。光源单波长、高强度、高稳定性多采用氩离子激光器或氦氖激光器 提供：488nm blue,633nm red,325nm UV,514nm green 空气制冷 水制冷（三）光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和小孔组成。滤光片主要分为：1.长通滤光片 长通滤光片使特定波长以上的光通过。2.短通滤光片 特定波长以下的光通过。3.带通滤光片 带通滤光片允许一定波长 范围内的光通过。（四）信号检测与分析 当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，细胞内不同物质产生不同波长的荧光信号。这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。二色镜 1 1 2 2 3 3带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光光信号分离，导向，各探测通道PMT接收并转化为电信号。光信号收集光信号分离，导向，各探测通道PMT接收并转化为电信号。光信号收集（四）信号检测与分析 1.散射光信号 散射光分为前向角散射和侧向角散射，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，称为细胞的物理参数（或称固有参数）。可提供细胞内精细结构和颗粒性质的信息。（四）信号检测与分析 2.荧光信号 当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析能了解所研究细胞的性质和数量。例如细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等数据处理FSC SSC FL1 FL2 FL3对数对数 线性线性 线性线性 线性线性 对数对数脉冲处理，模数转换光信号电信号记录数据，显示结果（面积，峰高，宽度）复习：1、FCM中是如何保证被测细胞是单个按顺序通过检测区？2、FCM中的光源一般是采用什么光源？为什么？请根据下FCM的工作示意图，大概说明其工作过程。细胞分选原理 水滴的形成 分选逻辑电路 水滴充电及偏转（五）细胞分选器 1小水滴的形成 压电晶体带动流动室振动，液流形成水滴。喷嘴的振动频率即每秒钟产生水滴的数目。当喷嘴直径为50m时，信号频率为40kHz，则每秒钟产生4万个水滴。若每秒钟流出的细胞是1000个，则平均每40个水滴中只有一个水滴是有细胞的，其他皆为空白。2逻辑电路 为了分选细胞，需要细胞在经过测量区时判断出哪个细胞满足了分选的条件，并产生一个逻辑信号，此信号驱动充电脉冲发生器，使之产生充电脉冲。3水滴的充电与偏转 当水滴从流束上将要断开时给整个流束充电，则水滴从流束上断开后便带有同极性的多余表面电荷。下落的水滴通过一对平行板电极形成的静电场时，带正电荷的水滴向带负电的电极板偏转，这样就可用容器收集水滴。Fluorescence Activated Cell Sorting488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector（六）FCM测量数据的存贮、显示与分析 目前FCM数据的存贮的方式均采用列表排队(List Mode)方式。目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光标记物参数数量在逐渐增多。采用List Mode方式可大量节约内存和磁盘容量。