建立一种宏基因组二代测序 DNA流程检测BALF标本的性能确认方法.docx

建立一种宏基因组二代测序DNA流程检测BALF标本的性能确认方法摘要目的建立一种宏基因组二代测序（mNGS）DNA流程检测BALF标本的性能确认方法。方法以Hela细胞代表宿主细胞，向无菌生理盐水中加入不同浓度Hela细胞、7种病原体（肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉和腺病毒）和干扰物质制备模拟BALF标本，同时收集临床BALF标本,以传统检测方法为参比方法，评价mNGS检测结果，确定mNGS的最低检出限、精密度、抗干扰能力、稳定性和准确度。结果模拟标本中，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉和腺病毒7种病原体的最低检出限分别为150、262、102、67、96、83CFU/ml和439拷贝/ml。模拟阳性标本中所有病原体重复检测结果符合率均为100%o抗干扰试验结果显示，人源核酸浓度越高，mNGS检出病原体序列数越少。以大肠埃希菌和宋内志贺菌评价mNGS对近源物种分辨能力，结果显示，当宋内志贺菌浓度为4000CFU/ml时，该系统能稳定分辨大肠埃希菌和宋内志贺菌。稳定性试验结果显示，标本进行1、2、3次冻融或在4回、-20日、-80回放置36h后病原体序列数无明显变化。与传统检测方法相比，17份临床标本的初步准确度为82.4%(14/17)o2021年10月25日至2022年9月14日同济医院同时进行mNGS和传统方法检测的临床BALF标本的持续评估结果显示，mNGS相对细菌培养、真菌培养、分枝杆菌培养、结核分枝杆菌培养和常规PCR技术的准确度分别为67.5%(472/699)、81.5%(570/699)>92.3%(335/363)、96.4%(350/363)和86.8%(132/152)。与常规PCR技术比较，mNGS检测耶氏肺抱子菌、腺病毒、肺炎支原体的准确度分另I为89.4%(8494)、93.3%(56/60)和87.1%(61/70)o结论通过制备模拟BALF标本以及以传统检测方法为参比方法，可以初步评价mNGS检测BALF标本的性能特征。呼吸道感染因其发病率和病死率高，成为全球主要的健康问题，下呼吸道感染尤为严重。下呼吸道感染病原谱广,及时获得病原学诊断，对于针对性治疗和预防具有至关重要的作用。宏基因组二代测序(metagenomicnext-generationsequencing,mNGS,又称高通量测序或下一代测序技术)因其无靶向检测病原体特点，在疑难感染病例诊断、少见病原体和新发病原体感染防治中发挥了重要作用，受到普遍关注1,2,3,4o然而，mNGS如此广泛的病原谱，加之操作的复杂性，使其性能确认难以实施，文献报道有限5。支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid,BALF）是下呼吸道感染疑难病例、少见和新发感染病例病原学诊断的重要标本，相较于血液、脑脊液等无菌标本，BALF病原学更为复杂，本研究借鉴近年国外一些实验室完成的脑脊液及其他体液标本的mNGS性能评估方案6,7,8,参考相关专家共识1,9,10,11,结合mNGS无靶向检测病原体特点，基于mNGSDNA流程检测BALF标本，建立初步性能评估和持续性能评估相结合的方法，探索逐步完善mNGS技术性能确认的方案。材料与方法一、材料（一）模拟阴性BALF标本以Hela细胞（人宫颈癌细胞）代表宿主细胞，将购自武汉普诺赛生命科技有限公司的高浓度Hela细胞1600Xg离心5min,倍比稀释后采用血球计数板计数。以含有2X105个/mlHela细胞的无菌生理盐水模拟阴性BALF标本。（二）模拟阳性BALF标本1.复苏菌株：将保存的肺炎克雷伯菌、白色念珠菌和新型隐球菌纯菌株接种于血平板，将肺炎链球菌、流感嗜血杆菌接种于巧克力平板，将烟曲霉接种于沙保罗斜面培养基，置于37C恒温箱中培养过夜（巧克力平板培养需维持5%C02环境）。2.配制菌悬液：复苏后的细菌和真菌经质谱鉴定正确后,用灭菌木棒挑取血平板和巧克力平板上的单个菌落，溶于无菌生理盐水，充分混匀，配制麦氏比浊度为05的菌悬液；向沙保罗斜面培养基中加入适量无菌生理盐水，轻柔颠倒混匀，将液体转移至比浊管，调整无菌生理盐水体积以配制0.5麦氏比浊度的烟曲霉菌悬液。3.制备阳性BALF标本：采用平板菌落计数法对倍比稀释后的菌悬液进行定量。病毒拷贝数则通过实时荧光定量聚合酶链式反应计算。根据研究设计的终浓度于模拟阴性BALF标本中加标不同病原体以模拟阳性BALF标本。以上模拟标本一次性配制，-20。C保存。（三）临床BALF标本将17份于华中科技大学同济医学院附属同济医院进行传统方法检测的临床BALF标本（14份阳性，3份阴性）用于mNGS的初步准确度确认。将2021年10月25日至2022年9月14日于该院同时进行mNGS和传统方法检测BALF标本的病例纳入本研究用于持续准确度评估。二、仪器和试剂1.仪器：REF21250DensiCHEK电子比浊仪VlTEK（法国梅里埃公司）、BioPreP-24生物样品均质仪（北京天根公司）、QSePl生物片段分析仪（台湾光鼎公司）、QUbit4.0核酸荧光定量仪（美国ThermoFisherScientific公司）NextSeqCN500高通量测序仪（美国Hlumina公司）、全自动微生物质谱检测系统Autofmsl000（郑州安图生物公司）。2.试剂：DNA提取试剂盒（粤穗械备20191662号，广州微远医疗器械有限公司）、基因组DNA片段化试剂盒（粤穗械备20202085号,广州微远医疗器械有限公司）、QubitdsDNAHSAssaykit试齐IJ盒（美国ThermoFisherScientific公司）、NeXtSeqCN500高通量测序试剂盒（美国illumina公司）。三、检测方法1传统检测方法：微生物分离培养包括细菌、真菌和分枝杆菌。除非结核分枝杆菌（non-tuberculousmycobacteria,NTM）通过16SrDNA测序外，其他病原体采用质谱鉴定、PCR技术如常规PCR技术检测BALF标本中耶氏肺抱子菌、咽拭子中腺病毒和肺炎支原体，以及GeneXPertMTB/RlF技术检测结核分枝杆菌（MyCObaCteriUmtuberculosis,MTB）/利福平耐药。2.mNGS：对600IBALF标本进行破壁处理，取300I破壁后标本进行核酸提取、建库和加标签。对纯化、扩增、再纯化后的文库进行片段大小和浓度测定，将合格文库加载至测序仪上进行75个循环单端测序，每个文库生成约2000万序列。测序数据下机后通过Trimmomatic软件去除低质量、长度小于40bp的序列和接头序列以获得高质量的数据。mNGS检测系统从美国国家生物技术信息中心(NatiOrIalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI,https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的RefSeq(https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)和nt/nr(https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)数据库中筛选人类相关序列，选用人类参考基因组hg38和中国人群的两个参考基因组YH2.0和HXl作为宿主参考基因组构建人源数据库(IDhostV2.0),从病理系统资源整合中心(PAThOSVStemSResourceIntegrationCenter,PATRIC,https：/www.patricbrc.org/)全球共享禽流感数据倡议组织数据库(GlobalInitiativeonSharingAvianInfluenzaData,GISAID,https：/www.gisaid.org/)、GenBank数据库(https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)、NCBI的RefSeq和nt/nr数据库中筛选微生物参考基因组，构建微生物数据库(IDseqDBV2.0：包含12142种细菌、2680种真菌、206种分枝杆菌、10061种病毒、654种寄生虫和120种支原体/衣原体)。通过BUiTOWS-WheeIerAligner软件(BWA：http：bio-特异性序列、鉴定置信度、相对丰度等信息。四、性能确认参数（一）检出限选择7种病原体（肺炎链球菌代表革兰阳性细菌、流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯菌代表革兰阴性细菌、白色念珠菌和新型隐球菌代表酵母菌、烟曲霉代表霉菌、腺病毒代表DNA病毒）建立不同物种的检出限。根据文献和预试验结果预估各病原体检出限，并在此浓度附近配制4个浓度梯度工作液（在模拟阴性BALF标本中加标不同浓度的代表性病原体制备模拟阳性标本），每个浓度至少重复检测10次。利用SPSS22.0（美国IBM公司）软件进行PrObit统计学分析，病原体95%检测阳性率时的最低浓度即为检出限。（二）精密度在模拟阴性BALF标本中加入3倍检出限（模拟弱阳性标本）的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、新型隐球菌和烟曲霉，加入1倍检出限（模拟临界阳性标本）的腺病毒得到模拟阳性BALF标本。每天重复10次检测该标本，连续检测2d。（三）抗干扰能力1.人源核酸干扰：根据精密度试验方案加入7种病原体,将模拟BALF标本中人源核酸浓度调整为2X105、2×106>2X107个/mlHela细胞，比较不同浓度人源核酸对检测结果的影响。2.近源物种干扰：将大肠埃希菌和宋内志贺菌按照3种不同比例混合后加入模拟的阴性BALF标本中（大肠埃希菌和宋内志贺菌的浓度分别为IoOo：1000菌落形成单位（colonyformingunits,CFU）/ml、4000：IoooCFU/ml和1000：4000CFUml）,以验证mNGS检测系统分辨近源物种的能力。（四）稳定性分别对精密度试验中制备的模拟阳性BALF标本进行1、2、3次冻融，评估冻融次数对检测结果的影响。将模拟的阳性BALF标本分别放置在4、-20、-8036h,评估保存温度对检测结果的影响。（五）准确度将同时接受BALFmNGS和传统方法检测，且检测时间相距5d以内的病例纳入mNGS准确度评估，以传统检测方法作为参考方法来评估mNGS准确度。同一病例中，mNGS未检测到传统方法所检出的任一病原体则被定义为mNGS假阴性,传统方法检测阴性，而mNGS检测阳性则被定义为mNGS假阳性。结果一、检出限通过Probit分析，确定了模拟标本中7种病原体的检出限，结果见表1。其中，细菌类病原体的检出限(平均171CFUml)高于真菌类病原体的检出限(平均82CFU/ml)。表1mNGS检测模拟BALF标本中7种病原体的检出限和精密度，,1病原体检出限精密度(重复检测结果符合率%)肺炎链球菌150(CFUml)流感嗜血杆菌262(CFUml)肺炎克雷伯菌102(CFU/ml)白色念珠菌67(CFUml)新型隐球菌96(CFUZml)烟曲霉83(CFUml)腺病毒439(拷贝/ml)100100100100100100100注：mNCS为宏基因组二代测序，BALF为支气管肺泡灌洗液,CFU为菌落形成单位二、精密度模拟阳性BALF标本中各病原体重复检测结果符合率均为Io0%,见表1。三、抗干扰能力本研究结果显示随着模拟标本中