葡萄糖氧化酶glucoseoxidaseGOD试剂盒说明书.docx

葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase,GOD）试剂盒说明书微法I（M）管/48祥注意，正式测定前取2-3个预期差异较大的样本做预测定刑定意义IGOD（EC1.1.3.4）广泛存在于动物、和植物中，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并产生HKh,是生物体中产生活性林的代谢途径之一.刑定原理：GoD催化产生HXh,过氧化物酶催化H£h氧化4-氨基安替比林偶联酚，生成有色化合物，在50Onm有特征吸收峰，颜色深浅与GoD活性成线性关系。试验中所需的仪器和设备：可见分光光度计/酶标仪、水浴摘、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、蒸憎水试剂的组成和配制：提取液：液体IOomLXl瓶，4T保存：缓冲液：液体30mLxl瓶，4C保存；试剂一：粉剂Xl瓶，-20C保存；临用前加入IOmL缓冲液充分溶解待用；用不完的试剂4T保存一个月；试剂二：粉剂Xl瓶，-2（TC保存；临用前加入IOmL缓冲液充分溶解待用；用不完的试剂4P保存一个月；样品测定的准备：1、细菌、细胞或组织样品的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（IO4个）：提取液体积（mL）为5001000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入ImL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或20OW,超声3s,间隔10s,重复30次）；8000g4.C离心Iomin,取上清，置冰上待W组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入ImL提取液），进行冰浴匀浆。8000g4P离心Iomin,取上清，置冰上待测.2、血清（浆）样品：直接检测。测定步II：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至500nm,蒸惚水调零。2、试剂一和试剂二的配制：参见试剂的组成和配制。3、煮沸样本的准备：取200HL样本至新的EP管中，95"C水浴IOmin,冷却至室温后，8000g4*C离心IOmin,取上清作为对照管的煮沸样本待测。4、测定操作表试剂CpLl对照管测定管样本50煮沸样本50试剂一7575试剂二7575混匀，35C保温15min后，于5()Onm波长处读取吸光度。AA=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。GOD活力单位的计算，a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下回归方程为y=2.8348x-0.0169：X为HQi标准品浓度(molmL),y为AAtI1、血清(浆)GOD活力的计算单位定义,每mL血清(浆)每分钟催化产生InmOIH2。2为一个酶活力单位。GODCnmoVminZmL)=(A÷0.0169)÷2.8348×V反总÷V1÷T×1()00=58.8×(A+0.0169)2、细菌、细胞或组织GoD活力的计算U)按蛋白浓度计算单位定义,每mg组织蛋白每分钟催化产生InmOlHQz为一个B活力单位。GOD(nmoVmin/mgprot)=(A+0.0169)÷2.8348xV反总÷(V样XCPr)Xl()00÷T=58.8×(A÷0.0169)÷Cpr(2)按样本鲜重计算单位定义：每g组织每分钟催化产生InmolH2O2为一个酶活力单位。GODCnmoVminZg鲜重)=(A+0.0169)÷2.8348×V反总÷(WxV样÷V样总)×10()0÷T=58.8×(A÷0.0169)÷W(3)按细菌或细胞密度计算单位定义：每一万个细菌或细胞每分钟催化产生InmOlHAh为一个酶活力单位。GOD(nmolmin104cell)=(A+0.0169)÷2.8348×V反总÷(500xV样+V样总)xlOOO=0.118×(A+0.0169)V反总：反应体系总体积.0.125mL；V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Ts反应时间，15min；Cpr：样本蛋白质浓度.mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。b用96孔板制定的计算公式如下回归方程为y=l4l74x-0.0169；X为H2O2标准品浓度(molmL),y为AA。1、血清(浆)GOD活力的计算单位定义：每mLlL清(浆)每分钟催化产生InmolHXh为个酶活力单位。GOD(nmoVmin/mL)=(A÷0.0169)÷I.4I74×V反总V样xlOOO=l18&AA+0.0169)2、细菌、细胞或组织GoD活力的计算(I)按蛋白浓度计算单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生InmolHXh为-个醒活力单位。GOD(nmoVmin/mgprot)=(A+O.OI69)÷1.4174×V反总÷(V样XCPr)XlOo0÷T=118×(A+O.OI69)÷Cpr<2)按样本鲜重计算单位定义：每g组织每分钟催化产生InmolHXh为-个酶活力单位。GOD(nmol/min/g鲜重)=(A+0.0169)÷I.4174×V反总÷(WxV样÷V样总)×10÷T=118×(A+O.OI69)÷W(3)按细菌或细胞密度计算单位定义：福一万个细菌或细胞每分钟催化产生InmOlH202为一个f活力单位。GOD(nmolmin,cell)=(A+0.0169)÷L4174×V反总+(500xV样V样总)xOOO=0.235×(A+0.0169)V反总：反应体系总体积，0.125mL：V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，15min：Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL：W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。