大鼠血小板因子3PF-3ELISA免费代测试剂盒说明书.docx

大鼠血小板因子3(PF-3)ELlSA免费代测试剂盒说明书试验原理：是固相夹心法前联免疫吸附实验(ELlSA).已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔能标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP.再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B,和酶结合物同时作用。产生颜色颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。分析类型：夹心ELlSA样本类型：血清、血浆、组织、尿液、及相关液体等样本产品型式：48/96孔板，可拆贮存方法：试剂盒未拆开，4保存。已拆开，标准品-20'C保存，其它4'C保存。运输条件：4C样本体积:50I自备材料1)蒸t水。2)酶标仪(45Onm)3）高精度加样及枪头：0.5-10uL,2-20uL,20-200uL,200-1000uL4）振荡器及磁力搅拌器等。5）37C恒温箱。安全性1）避免直接接触终止液和底物A、B.一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。2）实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。3）不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。样品收集、处理及保存方法1）血清-操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，IoooXg离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。2）血浆-EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。IoOoXg离心30分钟去除颗粒。3）细胞上消液-l0×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。4）组织匀浆-将组织加入适量生理盐水捣碎。100oXg离心10分钟，取上清液5）保存如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37"C或更高的温度加热解冻。应在室温卜.解冻并确保样品均匀地充分解冻.试剂的准备1）标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。2）洗涤缓冲液（50X）的稀释：蒸憎水50倍稀释。操作步骤1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数.每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入SOuI于反应孔内。3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37温育1小时。4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。5）每孔加入80Ul的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀,37C温育30分钟。6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加-次。7）每孔加入底物A、B各503,轻轻振荡混匀，37温育10分钟。避免光照。8）取出酶标板，迅速加入50Ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。9）在45Onm波长处测定各孔的OD值。局限6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。性能1.灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。2.特异性：不与其它细胞因子反应。3.重复性：板内、板间变异系数均小于10%。结果判断与分析1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值2、以吸光度OD值为纵坐标(Y),相应的待测物质标准品浓度为横坐标(X),做得相应的曲线，样品的待测物质含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。实验原理：用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗体的微孔中依次加入标本或者标准品、生物素化的抗体、HRP-标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物显色。底物在过氧化物Sj的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的目标蛋白呈正相关。用酶标仪在(45Onm)波长下测定测定OD值(吸光度)，计算样品浓度O