抗原的提取与制备.ppt.ppt

第一节第一节 免疫学技术的范畴与应用免疫学技术的范畴与应用一、免疫学技术的范畴二、免疫学技术的应用特点免疫学技术的范畴免疫学技术的范畴1、对免疫系统的组成成分的数量、状态的测定2、对具有免疫活性物质的定性、定量测定（范围较广）免疫学技术的应用特点免疫学技术的应用特点1、对象“包罗万象”2、方法“兼容并蓄”（牵涉到物理，化学，生物，医学，计算机等各学科）*如何学习和使用免疫学技术？基本原理的理解+说明书和手册（向仪器或试剂盒供应商索取或网上下载）第二节第二节 有关免疫学基本概念有关免疫学基本概念一、抗原的概念与属性二、免疫细胞的概念与分类三、免疫应答的概念与过程1、与抗体结合的物质2、能够被免疫系统识别的物质3、能够激活免疫细胞并与免疫效应物起反应的物质抗原抗原免疫原性免疫原性可识别、可反应性（诱导机体产生免疫应答的特性）免疫反应性免疫反应性 选择结合性（和免疫应答产物特异性结合的特性）抗原的概念与属性抗原的概念与属性*抗原和半抗原免疫细胞的概念与分类免疫细胞的概念与分类免疫细胞（免疫细胞（Immune cellsImmune cells）泛指所有参与免疫应答及与免疫应答活动相关的细胞。免疫活性细胞（免疫活性细胞（Immune competent cellImmune competent cell，ICCICC）能够接受抗原刺激、产生特异性的活化、增殖、分化并形成效应产物的淋巴细胞。免疫细胞的类型免疫细胞的类型 红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细胞免疫应答的概念与过程免疫应答的概念与过程免疫应答（免疫应答（immune response）免疫系统接触抗原后，免疫细胞对抗原进行识别；并使特异性淋巴细胞活化、增殖；表现出免疫效应的过程。免疫应答的阶段免疫应答的阶段1、抗原识别阶段（antigen-recognizing phase）2、淋巴细胞活化阶段（lymphocyte-activating phase）3、抗原清除阶段（antigen-eliminating phase）第三节第三节 抗原抗体反应的基本原理抗原抗体反应的基本原理一、抗原抗体反应的原理二、抗原抗体反应的特点三、影响抗原抗体反应的因素抗原抗体反应的原理抗原抗体反应的原理1、抗原抗体之间的作用力2、抗原抗体结合物析出原因参与抗原抗体相互作用的力参与抗原抗体相互作用的力1、电荷引力（库仑引力）2、分子力（Van der Waals力，分子随机产生的电偶极矩极化而引起的相互作用）3、氢键结合力（氢和电负性大的原子结合,带正电的原子核暴露于外,可吸引其它电负性大的原子）4、疏水作用力（由大分子中疏水基团相互接近.而形成的一种作用力）*以上作用力均非共价键单独的抗原或抗体不自行聚合析出单独的抗原或抗体不自行聚合析出的原因的原因亲水胶体的形成1、电荷排斥力（由蛋白质的等电点决定）2、水化层的形成抗原抗体的析出抗原抗体的析出抗原抗体的结合：可以导致电荷的中和水化层破坏 蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体，聚合析出需要电解质的辅助 抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点1、特异性2、可逆性3、适合比例性特异性及其相对性特异性及其相对性抗原A抗原C抗原B特异性反应交叉反应无反应抗体可逆性可逆性K（亲和常数）=Ag+AbAg Ab适合比例性适合比例性抗体含量抗原含量前带后带等价带网格学说网格学说（lattice theory）抗体过剩抗原过剩抗体抗体比例合适 抗原抗体反应的影响因素抗原抗体反应的影响因素1、电解质2、酸碱度（pH值6-8）3、温度（37-42。C）第四节第四节 免疫学检测技术的评价免疫学检测技术的评价一、评价标准 二、特异性与敏感性的关系评价标准评价标准Specificity（特异）：检测信号针对性和排它性Sensitivity（灵敏）：可测出的最低含量Simplicity（简便）：操作是否方便Safety（安全）：是否有污染，对操作者的伤害Saving（节约）：性能/价格比特异性与敏感性的关系特异性与敏感性的关系灵敏度高、特异性低（假阳性）特异性高、灵敏度低（假阴性）第一节第一节 抗原抗原/免疫原制备的基本概念免疫原制备的基本概念一、抗原制备的目的二、抗原的“纯度”三、抗原制备的主要技术途径抗原制备的目的抗原制备的目的免疫原：激活T、B细胞半抗原：检测相应抗体抗原的抗原的“纯度纯度”免疫原：除保留可被B细胞识别的抗原决定簇，还需保留足够的被T细胞识别的抗原决定簇半抗原：尽可能减少影响反应特异性的抗原决定簇抗原制备的主要技术途径抗原制备的主要技术途径天然抗原分离、纯化半抗原人工合成、载体联接抗原肽 合成、基因工程制备 第二节第二节 完全抗原完全抗原/免疫原的制备方法免疫原的制备方法一、颗粒性抗原的制备二、可溶性抗原的制备颗粒性抗原的制备颗粒性抗原的制备1、抗原的获取：采集分离2、无害化处理：去除对机体有毒成分，如用甲醛（细胞，细菌）可溶性抗原的制备与纯化可溶性抗原的制备与纯化1、处理与粉碎2、蛋白质分离富集3、单一组分提取4、抗原纯度鉴定 （蛋白质、糖蛋白、脂蛋白）处理与粉碎处理与粉碎组织粉碎：机械 高速捣碎机，研磨 生物 酶消化（蛋白酶、胶原酶）细胞破碎：物理 反复冻融，冷热交替，超声 化学 表面活性剂 生物 溶酶，自溶 蛋白质分离蛋白质分离选择性沉淀：盐析，有机溶剂沉淀，水溶性非离子型聚合物沉淀（聚乙二醇）透析技术：半透膜超滤技术：负压+滤膜 单一组分提取的方法单一组分提取的方法层析技术：凝胶过滤 离子交换 亲和层析 凝胶层析（分子筛）凝胶层析（分子筛）离子交换层析离子交换层析+亲和层析亲和层析单一组分提取的方法（续）单一组分提取的方法（续）离心技术：差速离心 密度梯度离心电泳技术：电泳洗脱 等电聚焦密度梯度离心法控制溶液的比重，将不同比重的分子或细胞通过离心方法加以分离分为：*不连续密度梯度离心法（单次密度梯度离心法）*连续密度梯度离心法不连续密度梯度离心法（单次密度梯度离心法）分离液仅形成单一的密度层，可在该层中获取与其比重一致的细胞或分子。该法较多用于外周血单个核细胞的分离，常用的分离液为Ficoll。聚蔗糖泛影葡胺 不连续密度梯度离心分离法 连续密度梯度离心法分离液可形成一连续的密度梯度层，在不同的密度梯度层中可获取所需的不同种类的细胞。该法可一次分离得到几种所需的不同类型血细胞。常用于外周血细胞的分离，使用的分离液为Percoll。聚乙烯吡咯烷酮 连续密度梯度离心分离法 单一组分提取的方法单一组分提取的方法电泳技术：电泳洗脱：根据蛋白质的电荷和分子大小分离等电聚焦：根据蛋白质的等电点分离电泳技术(等电聚焦)抗原纯度鉴定抗原纯度鉴定方法：电泳法 免疫法 层析法指标：电泳纯（电泳法）免疫纯（免疫扩散法，纯度要求高）第三节第三节 半抗原免疫原制备的方法半抗原免疫原制备的方法一、载体的选择二、半抗原与载体的联接载体的选择载体的选择 结构复杂的大分子结构复杂的大分子 蛋白质载体：BSA、HSA、OVA（卵清蛋白）、KLH（钥孔嘁血蓝蛋白）聚合多肽载体：多聚赖氨酸高分子聚合物载体：羧甲基纤维素半抗原与载体的联接半抗原与载体的联接1、连接方式：物理法（吸附）化学法2、化学连接方法：直接联接法：适用于带游离氨基或游离羧基的半抗原 间接联接法：适用于没有游离氨基或游离羧基的半抗原半抗原与载体直接联接半抗原与载体直接联接碳化二亚胺法碳化二亚胺法蛋白质-COO +R-N+=CN-R H-N+-R蛋白质-COO-C-NH-R+半抗原-NH2 O蛋白质-C-NH-半抗原+R-NH-CO-NH R半抗原与载体直接联接半抗原与载体直接联接 戊二醛法戊二醛法蛋白质-NH2 +半抗原-NH2+COH-（CH2）3-COH蛋白质-N=CH-（CH2）3 CH=N-半抗原半抗原与载体直接联接半抗原与载体直接联接 氯甲酸异丁酯法氯甲酸异丁酯法半抗原-COOH +Cl-COO-CH2 CH（CH3）2 O O半抗原-C-O-C-O-CH2CH（CH3）2+蛋白质-NH2 半抗原-CO-NH-蛋白质+HO-CH2CH（CH3）2 半抗原与载体间接联接半抗原与载体间接联接琥珀酸酐法琥珀酸酐法 O O半抗原-CH2 OH+C-O-C CH3 CH3 O半抗原-CH2 O-C-(CH2)2-COOH半抗原与载体间接联接半抗原与载体间接联接O-（羟甲基）羟胺法（羟甲基）羟胺法半抗原-C=O+H2 N-O-CH2-COOH 半抗原-C=N-O-CH2-COOH 半抗原与载体间接联接半抗原与载体间接联接一氯醋酸钠法一氯醋酸钠法半抗原-OH +Cl-CH2-COONa半抗原-CH2-COOH 半抗原与载体间接联接半抗原与载体间接联接重氮化的对氨基苯甲酸法重氮化的对氨基苯甲酸法HOOC-NH2 +NaNO2 HOOC-N=N半抗原-OH +HOOC-N=N半抗原-N=N-COOH OH 本章小结本章小结1、免疫学技术的应用范畴2、免疫学的基本概念3、抗原抗体反应的原理、特点、影响因素4、抗原制备的方法思考题思考题1、免疫学技术的应用范畴有哪些？2、体外抗原抗体反应有哪些特点？3、可溶性抗原的制备涉及哪些技术？4、如何使半抗原具有免疫原性？举例说明 半抗原与载体的联接方法。