氨基酸标样的分析.docx

氨基酸标样的分析一、实验目的(1)熟悉高效液相色谱仪的结构、分离原理和操作程序。(2)掌握氨基酸标样的分析方法、原理。二、实验原理氨基酸与PlTC发生反应生成的衍生物,在254nm处有最大吸光值。氨基酸衍生物进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积可进行定性和定量。该方法是柱前衍生法中的一种。PlTC方三、实验仪器和试剂1、仪器：高效液相色谱仪(带紫外检测器)。2、材料:氨基酸标样3、试剂：衍生液：异硫氟酸苯酯：甲醇：三乙胺：水(VN)=1：7：1：1正己烷、乙月青、乙酸、乙酸钠以上试剂中乙晴为色谱醇，水为二次蒸储水，其它为分析醇。四、实验步骤1、柱前衍生步骤：(1)将IOoUl衍生液加入100Ul氨基酸标样或样品中，震荡使混合均匀，室温放置1小时。(2)反应液中加入200Ul正己烷，充分震荡后放置使分层。(3)取下层溶液用一次性滤膜过滤器(0.45UI)过滤。(4)取滤液5ul注入HPLC。2、分离条件的设定(1)色谱柱:Shim-packVP-ODS4.6mmx15cm保护柱：Shim-packGVP-ODS4.6mmxIcm(2)流动相：A液：0.1M乙酸钠pH6.50(用乙酸调整，50Oml乙酸钠中约加2滴乙酸)。B液：乙晴/水=4/1(3)流量：ImImin柱温：36检测波长：254nm(4)梯度洗脱程序：TIME(min)FUNCVALUEO.OlBCONC103BCONC1021BCONC3921.01BCONC8025BCONC8025.01BCONC1035STOPSTOP3、数据采集打开real-timeCSanalysis软件采集数据并对数据进行分析五、注意事项1、流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用045um或更细的膜过滤)。2、流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。3、不能用纯乙晴作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。4、每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。5、气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。6、如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。六、思考题1、试述反相离子对色谱的分离机理。2、试述本实验氨基酸分析的基本原理和方法，除了本方法外，还有那些氨基酸分析方法？