Ames试验在水质检测方面的应用.docx

采用SDS2PAGE分析发酵液的菌体和上清IoONe.、液实验表明：该酶基因的表达产物可以分泌到A细胞外，表达量占菌体蛋白的12%左右；而类II似报道中纳豆激酶是以融合蛋白的形式表达，离601表达量占菌体蛋白的1512%口。表达动态研g40究表明：重组菌在30第养6h后，在42磷*I导5h,可以获得较高的表达量，相当于120个W20I尿激酶单位nL菌液,是有关报道的2倍1四o0I«'«'大肠杆菌表达外源基因产物多数是以包涵体形°204°80100120式分泌至周质空间，本实验所获得表达产物大图5重组质粒在EcoilHBIOl中的稳定性部分存在于发酵液中，即使通过超声波破碎细分离稳定性，,结构稳定性胞壁后也不能令产量提高，证明该重组子为分泌表达型，究其原因，可能是由于PCR扩增的目的片段还包含有信号肽序列，可令表达产物分泌至胞外。重组质粒的稳定性实验表明：该质粒具有良好的分离稳定性，而结构稳定性较差，分析原因，可能是由于表达载体PBV220携带人工构建的PRPL串联启动子，而此类启动子极易发生外源基因的缺失，因此重组质粒的结构稳定性有待提高。参考文献1须见洋行1化学占生物11991,29:119-12312永井利郎1日本食品科学工学会志11999.46(2):39-441傅利,李荣藻,李晶.等1生物工程进展，1997,17(3):313314JNad三uraT,YouherY,EijiIlBiotechBiocheml1992,56(11):1869-18711(5李建武1生物化学原理和方法1北京：北京大学出版社11994：275-27716罗立新，凌均建.黄志立，等1华南理工大学学报，200().28(10):596217原敏夫，田所优子，里山俊哉1日本食品科学杂志，1996.43(2):173-17518邱晓颖，朱红惠.卢秋雁，等1高技术通讯，1998,16(1):52-5519吴乃虎主编1基因工程原理(上册)1北京：科学出版社.1999:229-230110张淑梅.张云湖、赵晓祥.等1中国生物化学与分子生物学报11999.15(6):912-9151Ames试验在水质检测方面的应用林朝晖(广州市自来水公司广州510160)摘要：近年来，水体污染日趋严重，各国学者从氯化后饮水中分离出多种致突变、致癌物质。为此我们采用AmeS试验，对珠江流域主要取水点的水源水和对应自来水中的有机致突变物污染情况进行了研究。研究表明.部分取水点的有机致突变物污染较严重，并且氯化消毒后自来水的致突性大于水源水的致突性。因而，加强饮水中致突变物质的检测，改进净水消毒剂和净水流程很有必要。关键词：鼠伤寒沙门氏菌，野生型，突变型，致突变，氯化消毒中图分类号：Q93文献标识码：A文章编号：025322654(2002)0320066204收稿日期：2001204225.修回日期：2001206230THEAPPLICATIONOFAMESTESTINTHEEXAMINATIONOFWATER1.INZhab2Hui（GuangzhouWaterSupplyCompany.Guangzhou5IOI6O>Abstract:Inrecently,thepollutioninWaterismoreandmoreserious.Scientistsdetectedsomecarcinogensinthechlorinateddrinkwater.WedetectedthemutationofthesourcefateranditschlorinateddrinkwaterinthePearlRiverbytheAmcstest.ThestudyShoWSsomesampleshavehighmutationandthemutationofthechlorinateddrinkwaterishigherthantlatofsourcewater.saresult,itisnecessarytostudythenutationofdrinkwaterandimprovethedrinkWaterdisinfectingandproducingtechnique.KeyWOrd:SalmonellatyphimuriumWildspeciesMutant.Mutation,Chlorinate饮用水与健康关系密切，正常人每天必须饮用23L水以维持生命所需。近年来，随着经济的发展、人口骤增，水体污染日趋严重，各国学者先后从氯化后饮水中分离出多种致突变、致癌物质，根据一系列饮水与肿瘤的流行病学调查显示，饮水污染与肿瘤死亡率之间有一定的相关关系，饮水中的致突变物质污染日益引起人们的重视。为保障供水水质，1999年1月，我们采用Ames试验，对珠江流域的8个主要取水点的水源水和对应自来水中的有机致突变物污染情况进行了研究。AmeS试验是检测具有遗传毒性的化合物对DNA碱基损伤的一种灵敏、快速、简便的方法。其原理主要为人工诱变鼠伤寒沙门氏菌菌株使其操纵子基因点突变，形成组氨酸营养缺陷型突变菌株。这种菌株不能合成组氨酸，因而在无组氨酸的培养基上不能生长。当在具有致突变性化学物质的作用下（有的需要肝微粒体酶的活化），可使突变型沙门氏菌回复为野生型，表现为即使在无组氨酸的培养基上也能生长。由此根据受试物可以使突变型沙门氏菌菌株在无组氨酸的培养基上的生长能力来衡量该物质的致突变能力。1试验方法IH测试菌种的选择与鉴定我们采用美国加州大学AmeS实验室提供的鼠伤寒沙门氏菌株TA98和TAlOO两种菌株。其特点敏感性强，特性变异小且不易丢失。可分别检出移码型突变物和碱基置换型突变物。由于菌种有紫外线抗性基因突变、深粗糙型突变、易错误修复系统，增加了菌种的敏感性，因此在实验前应严格鉴定这几种特性保证实验结果的可信性，菌种鉴定结果均符合要求。112水样的处理进行水中致突变物质检测时，水样的浓集往往是成功的关键。目前，国外采用的水样浓集方法甚多，其中树脂吸附法操作简便并具有吸附量大、对不同物质有效的特点而广泛使用。由于水中致突变物质多为中性或极性很小，XAl磔树脂对这类物质吸附效果最佳，因此我们采用XAD22树脂作吸附剂。市售XAD22树脂需用重蒸福水洗去所含氯化物，再用丙酮、乙酸、甲醇分别回流8h后装柱，每根玻璃柱装20mL树脂。由于正常人每天必须饮用23L水，因此我们选择2L水样的浓集物为最高受试浓度，每个水样需取60L,以30mLmin的流速过柱。水样过柱后，吸附于树脂上的致突变物质用90mL丙酮洗脱。洗脱液放入真空离心浓缩器中45°解干，浓缩物用适量二甲基亚碉溶解，定容至3E,经无菌抽滤后，230Q（箱保存备用。使用时，稀释至1/2,1/4浓度各OIlmL,相当于水样210L、IlOL、015L。113试验步骤试验采用标准平皿法，每皿加入受试浓缩液OlImL,阳性对照选用公认的致突变物质稀释成不同浓度。非活化（不加肝微粒体酶S9）者，TA98用100wnlL的22AF,TAlOo用L的叠氮化钠；活化（加S9）者，TA98和T100均用100rL的22AFo阴性对照为二甲基亚碉。各浓度待测物做3个平行测定，37养两天后用自动菌落计数器计算每皿的回变菌落数，记录平均值及标准偏差。回变菌落数为阴性对照的两倍或以上，有剂量反应关系、标准偏差不超过均数的20%,即可判为致突变阳性。114数据处理由于在测试浓度范围内，虽有剂量反应关系，回变菌落数不一定能达到阴性对照的两倍以上。为比较各水样致突变性的强弱，我们对各水样的致突变回归系数作显著性检验，求出其平均最低致突变水样量。即回变菌落数为阴性对照的两倍时，加入的受试水样体积。水样的平均最低致突变水样量值越小，致突变性越强。反之，值越大，致突变性越弱。2结果从测试结果来看，全部水样在测试浓度范围内，TAlOO菌株在加或不加S9时均未诱导回变菌落数增加。在测试浓度范围内，B、E源水在加或不加S9时，TA98菌株不能诱导回变菌落数增加。在TA98+S9的情况下，A、C、D、F、G、H源水在中剂量或高剂量出现了回变菌落数增加，且回变菌落数为阴性对照的两倍或以上。而在TA982S9的情况下，A、C、D、G、H源水在中剂量或高剂量出现了回变菌落数增加，且为阴性对照的两倍或以上。各点的自来水水样中，除B、E自来水在加或不加S9时，TA98菌株不能诱导回变菌落数增加外，其余各点的自来水水样均可直接和间接地诱导TA98的回变。各水样平均最低致突变水样量如表1所示。3分析表1各水样平均最低致突变水样量（L/皿）311各取水点的水源水采样水源水自来水和对应自来水中的有机.i.TA98,S9TA98"hw均值TA98+S9TA982S9均值致突变物诱变类型A11X01153116701791KM0192B2163213921512159210821343HH珠江流域的8个C113911391139110711631135主要取水点的水源水和D016201610192017411130194E213121142123212321212122对应自来水中的有机致F117121071189111711271122突变物，在测试浓度范围内，不能诱发碱基置GH1173016911080174114201721158IBQ1118U531138U65换型突变。31112在测试浓度范围内，B、E源水不能诱发碱基移码型突变。31113AsC、D、F、G、H源水在测试浓度范围内具有间接致突变作用，在肝微粒体酶（S9）的活化下，能诱发碱基移码型突变。31114A、C、D、G、H源水在测试浓度范围内具有直接致突变作用，不需肝微粒体酶(S9)的活化，能诱发碱基移码型突变。31115除B、E点外，其余各点的自来水水样在测试浓度范围内均可直接和间接地诱导TA98的回变，诱发碱基移码型突变C312各取水点的水源水和对应自来水水样致突变性的比较为了更直观地对各点水样致突变性的强弱进行比较，我们把各点水样的平均最低致突变水样量值作图比较如图1。从图1可以看出，除远离市区的B点3|图1各点水样最低致突变水量比较<»雷来水和E点外，各取水点的水源水和对应自来水水样在测试浓度范围内，鼠伤寒沙门氏菌，哺乳动物微粒体酶试验均能得出阳性结果。水源水水样的致突变性大小顺序排列为：H>D>C>G>A>F>E>Bo自来水水样的致突变性大小顺序排列为：A>D>F>C>G>H>E>Bo从水源水水样的致突变性大小顺序排列来看，越靠近市区，其致突变能力越强。这说明，市区污染物的排放，是水源水中有机致突变物的主要来源。自来水水样的致突变性大小顺序排列与水源水有所差异，是因为H点由于污染过于严重而发生水臭，不得不投加活性炭粉去除臭味。活性炭粉对有机致突变物有很好的吸附作用，从而使该点自来水水样的致突变性大为降低。A、F两点水源水中有机致突变物在氯化后致突变能力大为增强，也使该两点自来水水样的致突变性提高。313水源水和氯化消毒后自来水水样致突变性的比较从图1可以看出，除投加活性炭粉的H点外，氯化消毒后自来水水样致突变性比相应水源水水样要高，这说明氯化消毒过程中氯与源水中的各种有机物发生的反应,产生了有机致突变物质。4vti