Ames试验检测硫芥的致突变作用.docx

Ames试验检测硫芥的致突变作用李奇慧,董兆君(第三军医大学预防医学系军事毒理学教研室,重庆400038)摘要目的应用AmeS试验检测系统观察硫芥的诱变活性。方法选用TA97,TA98,TA100,TA102标准测试菌株,采用标准平板掺入法检测硫芥的诱变活性*加S9混合液作为体外代谢活化系统。结果硫芥在S9活化和非活化两种测试条件下,85001皿浓度范围内,诱发TA98、TAlOO两种测试菌株回变菌落数与阴性对照组相比无明显增加，在832/皿浓度范围内，诱发TA97和TA102产生的回变菌落数与阴性对照相比无明显增加，在1255004皿测试浓度范围内，对TA97和TA102产生的回变菌落数与阴性对照相比均达到阴性对照两倍以上。结论硫芥具有碱基置换及移码型的直接诱变特性和间接诱变特性，间接诱变活性较直接诱变活性减弱。关键词硫芥;AmeS试验;突变中图分类号R394,8;Q754文献标识码A文章编号I672-5042(2004)04-0235-02Studyonmutagenicit5,ofsulfurmustardbyAmestest1.IQi2hui,DONGZhao2jun(DepartmentofMilitar>,Toxilogy,ThirdMedicalUniversity,Chongqing400038,QIina)Abstract:ObjectiveThemutagenicityofsulfurmustardwasobservedbyAmcstestdetectionsystem.MethodsTheTA97,TA98,TAl(X)andTA102standardtesterstrainswereusedtodetectthemutagenicityd,sulfurmustardbyusingstandardplateincorporationversion.AddingS9mixturetotheplatefortheuseofmetabolicactivationsysteminvitro.ResultsWithandwitl)utS9activation,thereisnoobviousincreaseofthereversestrainclonesinbothTA98andTA100strainsfrom85000Qlateconcentration,comparedwithnegativegroup.TheTA97andtheTA102strainshadthesamereactionatconcentrationsof832g1)late.ThereversestrainclonesinducedbysulfurmustardinTA97andTA102strainweretwiceasmuchasnegativecontrolgroupatncentrationsof125-500IgJ>late.ConclusionSulfurmustardwascharacterizedbythedirectandindirectmutagenicityWithsubstitutionmutantandframeshiftmutant.KCyWords:sulfurmustard;Amestest;mutation由于硫芥在生产、使用、储存等过程中处理不当致中毒事件屡有发生。硫芥中毒可对DNA产生强烈损伤除了细胞毒作用外,硫芥可能尚具有遗传毒作用0AmeS试验是遗传毒理学中应用最广泛的检测基因突变的方法之一。它是利用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphymurium)的组氨酸缺陷型突变株(his-)发生回复突变的性能,对化学物质致突变性进行初步筛选的短期实验方法。其实验结果与啮齿类致癌试验有很高的符合率。本文应用AmeS试验评价硫芥的致突变性，以期阐明硫芥的遗传毒理学基本特征,为探讨硫芥的遗传毒性以及可能的致肿瘤作用机理提供一定的实验依据。基金项目全军十五”重点课题资助项目(OILo54)作者简介李奇慧(1976)，女,黑龙江省肇东市人,主治医师,硕士研究生,主要从事遗传毒理学方面的研究。电话(023)68752356收稿日期2004-01-21修回日期2004-03-12Indirectmutagenicityisweakerthandirectones.1材料和方法1.1 材料.实验毒剂实验用毒剂硫芥由军事医学科学院六所提供,纯度为97.5%,用1,3-丙二醇溶解,1.1.2 试验菌株采用标准测试菌株TA97,TA98,TAlOO,TA102四株菌,菌株由Ames实验室提供,液氮保存。经组氨酸营养缺陷鉴定,深粗糙型(rfa)鉴定avrB缺失鉴定,R因子和PAQl质粒的鉴定及自发回变数测定,菌株均合格。1.1.3 培养基，浦养肉汤培养基:用于增菌和鉴定菌种：营养肉汤琼脂培养基:用于鉴定和分离菌种；重层培养基:含V2B盐贮备液,20%葡萄糖琼脂水溶液；h层培养基:每IooOml含D2生物素12.4mg口盐酸组氨酸9.5mg,氯化钠5g,琼脂67.5g01.1.4 肝微粒体酶活化系统(S9)制备采用苯巴比妥钠和琮黄酮联合诱导方法制备。操作过程需注意无菌和局部冷环境*1.2 方法采用黄幸纾等描述的方法。选用TA97,TA98,TAlOO,TA102标准测试菌株,采用标准平板掺入法检测硫芥的诱变性。向2ml融化并保温在45维!上层培养基中依次加入细菌培养液01M,受试物溶液0.1ml,S9混合液或磷酸缓冲液(无需活化时)0.5ml,即刻在震荡器上混合均匀,迅速倒在底层培养基表面,使之均匀分布于底层之上。水平放置凝固后置于37恒温培养48ho在确认细菌背景菌苔生长良好,与溶剂对照相比无明显稀疏的条件下计数回变菌落数,取两次6皿平均值，如超过对照一倍以上并有剂量反应关系时判为阳性结果。2结果硫芥在S9活化和非活化两种测试条件下.850Odinl浓度范围内,诱发TA98、TAIOo产生的回变菌落数与阴性对照相比均无明显增加；在8324皿浓度范围内，诱发TA97和TA102产生的回变菌落数与阴性对照相比无明显增加；在125500k皿浓度范围内、诱发TA97和TA102产生的回变菌落数与阴性对照相比均达到阴性对照两倍以上。上述结果表明在12550()用皿测试浓度范围内硫芥对TA97和TA102两种测试菌株有致基因突变作用。(见表1.2)o表1硫芥的AmeS试验结果(2S9)(个IlnI,x±s,n=6)剂0"gDll)W7W8TAlOOIAIG2500117283+103.221014.00+1.6794.83+5.12977.00+11.58x,125304.00±13.423316.00+1.9071.33±4.32562.33H2.58：«32260.50+6.5717.00±2.1050.00+7.82324.33+10.058152.80+34.4()23.00+3.5244.50+4.93316.83+8.91空白对照143.00+15.7022.33+1.7572.17+4.92260.00+8.85溶媒对照134.67+12.1421.83±2.3271.17+2.64270.33±6.7745<X)正定霉素-CXJOMVC阳性对照(0.5。皿)(4OdIilI)(o.5f11m)(0.5gB)452.67±21.3严527.67+14.64xi634.67+19.511°667.67±13.2Sa注:与空白对照组比较，33P<0.01表1硫芥的AmeS试验结果(+S9)(个nm,x±s,n=6)剂量Mg11Dl)W7W8TAlOOTAl(300950.83±34.而"28.33±1.9796.00+5.90MW-OOiiaey0125308.50+19.55xl28.83+2.4093.5013.94531.I7+8.213332244.67+13.8228.33±2.9497.00+7.87422.17+9.998197.83±11.4330.67±2.5887.67+4.46368.83+9.06空白对照I42.17+5.M23.00+2.1980.67+4.93259.33+5.89溶媒对照135.00±4.5620.00+1.798183+3.54263.67+14.53眇对照138.1713.8228.67±2.5880.1712.71270.1717.88阳性对照581.17+16.23510.67+6.5a494.67±20.t'876J7±12.642Z1F(6O0皿)注:与空白对照组比较，33P<0.013m硫芥因其理化性质稳定,毒性大，穿透性强,作用隐蔽，持久性大等特点，而成为医学防护研究的对象叫。硫芥是一种烷化作用很强的化合物，曾经作为候选抗癌药物进行动物实险O但长期接触硫芥的生产工人上呼吸道癌症发生率增加”接触硫芥的渔民外周血淋巴细胞姐妹染色单体交换率升高。这些资料提示,硫芥很可能具有遗传毒性的远期危害。AmeS试验是检测化学诱变剂的常规方法之一。它是一种快速获得化学物质致突变性以及潜在致癌性资料的有效手段,对于进一步探讨化学物质导致遗传物质突变的分子基础有重要的价值。其原理是鼠伤寒沙门菌突变株(组氨酸缺陷型)在缺乏组氨酸的培养基上不能生长,当受试物使之能生长时,说明其所携带的突变已被纠正或补偿,即发生了回复为野生型的突变。故可根据在无组氨酸的培养基上菌落生成数量来检测受试物是否为致突变物。本文应用经典的AmeS试验方法研究硫芥的遗传毒性。结果显示硫芥在125500IgI皿浓度范围内诱发TA97和TA102产生的回变菌落数与阴性对照相比均达到后者的两倍以上，并有剂量效应趋势,说明硫芥具有碱基置换及移码型的直接诱变特性,在微粒体酶参与下,硫芥兼有碱基置换和移码型的间接诱变特性,证明本方法是评价硫芥遗传毒性的良好方法。硫芥间接诱变活性较直接诱变活性有所减弱,其原因可能是在微粒体酶系统作用下,硫芥代谢转化为芥子碉、芥子亚碉、二羟二乙硫酸等无毒或低毒性产物,而后者的诱变活性较弱所致。有关硫芥导致遗传物质突变的分子基础以及对其进行远期危害评价的进一步研究尚在进行中。参考文献1LakShmanaRaoPV,VijayaraghavanR,BhaSkarAS.Sulfurmus2tardinducedDNAdamageinmiceafterdermalandinhalationex2posureJ.Toxicology,1999,139(1-2):39-51.2DacreJC.GoldmanM.Toxicologyandphaacologyofthechem2icalwarfareagentsulfurmustardJ.PharmacolRev,1996,48(2):289-326.3黄幸纾,陈星若.环境化学物致突变、致畸、致癌试验方法M.杭州:浙江科学技术出版社.1985.219234.4罗成基，欧阳子倩.核、化学武器损伤防治学M.北京：人民军医出版社,1994138140.5袁素波，王治乔.肿瘤化疗药物的致癌性及致癌机制J癌变