外周血单核细胞亚群分布与类风湿关节炎发病相关性.docx

外周血单核细胞亚群分布与类风湿关节炎发病相关性类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是一种病因未明，发病机制复杂的自身免疫性疾病，关节滑膜组织的慢性炎症性增生、血管翳形成及骨质破坏是其主要的病理特征1,2,3o单核细胞是机体固有免疫的关键细胞，主要通过吞噬、抗原提呈和分泌细胞因子来发挥其免疫功能,根据单核细胞表面CD14和CD16的差异表达，可将单核细胞分为3种亚型4:经典型(c1.assica1.monocytes,CD14+CD16-,CM),中间型(intermediatemonocytes,CD14+CD16+,IM)与非经典型(non-cIassicaImonocytes,CD14+CD16+,NCM)o有研究显示RA患者外周血单核细胞亚型分布存在异常，并与RA的疾病易感性及疾病活动程度相关4,5o为阐明RA患者外周血单核细胞亚型分布及其功能异常与RA发病的相关性，本研究检测了62例RA患者、52例健康对照(hea1.thycontro1.,HC)和12例疾病对照患者外周血单核细胞亚型分布差异，分析了3组间各亚群细胞人白细胞抗原DR(human1.eukocyteantigenDR,H1.A-DR)表达及促炎症细胞因子肿瘤坏死因子CI(tumornecrosisfactor,TNF-a)分泌水平差异。对象与方法一、对象1.RA组：2020年6月至2021年12月在同济大学附属东方医院收集62例RA患者，其中男性16例，女性46例，年龄(49.71±13.15)岁。诊断参照2018年中国类风湿关节炎诊疗指南2,根据欧洲风湿病联盟推荐的RA疾病活动指数28评分将RA患者分为活动期(18例)和静止期(62例)o2.疾病对照组：2020年6月至2021年12月在同济大学附属东方医院就诊的患有系统性红斑狼疮(systemicIupuserythematosus,S1.E)、干燥综合征(Sjogrensyndrome,SS)、强直性脊柱炎等其他自身免疫性疾病的12例患者，其中男性2例，女性10例，年龄(45.50±14.60)岁。3.健康对照组：2020年6月至2021年12月在同济大学附属东方医院收集健康志愿者52名，其中男性29名，女性23名，年龄(51.71±11.14)岁。本研究通过本院伦理委员会审批(2016伦审第011号)，免除患者知情同意。二、方法1.试剂与仪器：FiCO1.I-PaqUe试剂购自美国GEHeaIthCare公司；胎牛血清(fetaIbovineserum,FBS)购自美国GibCO公司；磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsa1.ine,PBS)购自中国EURO1.MMUN公司;CD14-别藻青蛋白(a1.Iophycocyanin,APC)、CD16-藻红蛋白(phycoerythrin,PE)-CY7、H1.A-DR-PE.TNF-PE.Brefe1.dinA均购自美国BDPharmingen公司;固定齐IJA和破膜剂B购自荷兰NordicMubio;十二项细胞因子检测试剂盒购自江西赛基生物技术有限公司。BDFACSCantoI1.细胞仪（BD公司）;二氧化碳培养箱（海力电科学仪器有限公司）；BeamCyte流式细胞仪（常州必达科有限公司）。2 .临床样本及数据收集：记录研究队列中包括白细胞数、中性粒细胞数、中性粒细胞比例、单核细胞数、单核细胞比例、C反应蛋白（C-reactiveprotein,CRP）、红细胞沉降率（erythrocytesedimentationrate,ESR）、类风湿因子（rheumatoidfactor,RF）和抗环瓜氮酸肽抗体（anti-eyeIiccitru1.Iinatedpeptideantibody,CCP）在内的临床参数，以便进一步分析。收集来自RA、HC和疾病对照的EDTA抗凝血样品和血清。3 .流式细胞术：通过FiCO1.I-Paque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（periphera1.b1.oodmononucIearce1.1.,PBMO,并将其重悬于含有1%FBS的PBS中。将PBMC（5×105个）与抗CD14-APC、CD16-PE-CY7、H1.A-DR-PE避光染色20min,并用含1%FBS的PBS洗涤。使用BDFACSCantOI1.细胞仪对PBMC进行分析，荧光值用平均荧光强度（meanfIuorescenceintensity,MFI）表示。4,胞内细胞因子染色：将上述所得PBMC（5X105个）与101./m1.Brefe1.dinA在37'C培养箱中共同培养4ho如上所述，将细胞用含1%FBS的PBS洗涤2次，然后用抗CD14和CD16染色。用固定剂A固定细胞15min后用含1%FBS的PBS洗涤。随后用破膜剂B渗透，同时用抗TNF-Q-PE避光染色30mino洗涤染色细胞并用BDFACSCantoI1.细胞仪进行分析，荧光值用MFI表示。5 .胞内细胞因子染色：采用十二项细胞因子检测试剂盒检测血清中TNF-Q的含量。将血清与捕获微球缓冲液及荧光检测试剂充分混匀后，室温避光孵育2.5h,随后用1m1.PBS溶液洗涤。使用Bean1.Cyte流式细胞仪进行检测分析。6 .统计学分析：采用SPSS21.0软件进行统计分析，对所有定量资料进行正态性和方差检验，正态分布的用元±S表示,非正态分布的用M(Q1,Q3)表示，3组间独立样本使用Kruska1.-WaIIisH检验，对有统计学差异的指标进行两两比较分析；2组间独立样本采用Mann-WhitneyU检验；配对比较采用WiIcoxon配对符号秩检验；采用Spearman相关系数检验分析外周血IM比例与CRP.类风湿因子、血沉的相关性；采用1.OgiStiC回归分析IM比例、CRP、类风湿因子与RA发病的相关性；定性资料采用X2检验；采用受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC曲线)分析IM比例诊断RA的效能。以P<0.05为差异有统计学意义。结果一、RA和对照组一般临床资料62例RA患者、52例HC和12例疾病对照的一般临床资料见方法学和表1o3组间性别差异有统计学意义(2=12.760,P=O.002),年龄差异无统计学意义(H=30134,P=O.209)。表1RA和对照组一般临床资料前红蜩胞沉It率(mm1.h,i±a)C反应蝎白(*01.M(Q1.6)1MTNF-n1.Mg.Qi)类风濯因子ku1.,M603)1CCP®性率(W(×1091.x±)中住愧a胞或x1091.,M«h.6)1中性险维跑比M(%>.x±s)单檀细胞数(×1O91.,M«h.03)单模细胞比M(.X±«)RAff1."62)27.81±17.384.10(3J8.12.98)3.66(1.39.11.34)a51.20(22.53,185.18)a88.71-894.10(2.98,5.13)a65.8818.88a0.40(0.40,0.50)a7.51±1.91aHCff1.(32)3.60(3.20,4£0)1.53(0.75.2.01)b3.XS(2.00.4.35)b05.96±0.973.35(2.83,4.20)b56.59*7.47b0.30(0.30,0.40)b5.M±1.04b疾题照ta(/>-12)3.20(1.83.3.70)b1.71(1.20.4.06)8.50(2.25.22.55)b9.16.35±2.95Z95(2.71.3.53)60.80115.610.40(0.40,0.68)8.44±3.40a<x2ff1.9.017.64471.35033.1512.27611.63528.04424.73327.4690.011<0.1.<0.1.<0.0010.320.3<0.001<0.001<0.001注：HC为健康对照,RA为期闭关节炎.CCP为抗环爪氨酸抗体.与HCStt®.a005:与RAff1.比皎.b0.05.红姬Ie沉博率强考范围：0i8m1.h.Cfi应置白参考范S：0-8mg1.血清TNF。俗考范H8：<55ng1.,奘风湿因子参考范&:020kW1.CCP参考结般：的性.白细胞数参考范H8：(3.5-9.5)×1091.中性IC细胞数参考范S:(1.8-6.3)×1091.,中性15强比例参考湖8：40%-75%,中极侬网K番考公网：(0.10.6)×1091.曲帆6比例辞考范B8：3%103组单核细胞绝对值和比例差异均有统计学意义，RA组单核细胞绝对值和比例高于HC组，且差异有统计学意义(P<0.001,P<0.001)O二、RA单核细胞亚型分布流式细胞术圈门见图1。通过流式细胞术检测分析62例RA、52例HC及12例疾病对照组外周血单核细胞亚型分布差异。与HC组和疾病对照组相比，RA组CM比例下降，IM比例增加，且差异有统计学意义(表2)。与HC组相比，RA组的NCM比例变化差异无统计学意义，疾病对照组的NCM比例升高。注；电A21.响敝射光(FSC)AtaH去魏Ii连体.SB1.B用FSC-A和«峋敝射光(SSC)-AWPeMe中的吨侬B进行JM.(E1.Cff1.aM4进一凰门>M+8电.S1DCD14+OM金盛典5!Wg®«(CM),814+816+为中闻(IM),CDI4+CD18为升Se(NCM)图1单核细胞亚型流式圈门表2RA组和对照组单核细胞亚型分布差异%,闻（Q,0）组别例数CMIMNCMHCig5288.94(86.36,91.72)b7.89(5.36,10.75)b2.22(1.39,3.74)RA6385.49(76.91,89.21)a11.65(8.47,17.89)a2.49(1.74,4.66)疾颜寸照组1290.26(80.25,92.56)5.56(4.17,8.27)b5.13(3.39,9.85)aM1.11.38920.81510.640殖0.003<0.1.0.5注：CM为经典型单核细胞，IM为中间型单核细胞，NCM为非经典型单核细胞，HC为健康对照，RA为类风湿关节炎；与HCst啜，aP<0.05;与RAS疑，bP¢0.05三、RA单核细胞亚型TNF-Q分泌水平差异胞内细胞因子染色结果显示（表3,图2）,和HC组及疾病对照组相比，RA患者单核细胞总体胞内TNF-水平没有显著变化，但是IM和NCM分泌TNF-Q的能力增强，CM分泌TNF-Q的差异无统计学意义。在RA组和对照组中，IM自发分泌TNF-Q的能力最强，其次是NCM,而CM自发分泌TNF-Q的能力最弱，差异均有统计学意义（P均小于0.05）oRA患者IM胞内TNF-水平和血清TNF-Q水平呈正相关，差异有统计学意义（图3）。表3RA和对照组单核细胞亚型TNF-分泌MFI,"(Q,Q)J伊股CMIMNCMHCff1.281129.5(1038.0,1291.5)972.5(840.5,1077.5)b2269.0(1865.8,242