嵌合抗原受体-T细胞免疫治疗中流式细胞术动态监测调节性-T淋巴细胞水平及其临床意义.docx

嵌合抗原受体-T细胞免疫治疗中流式细胞术动态监测调节性r淋巴细胞水平及其临床意义嵌合抗原受体(ChimeriCantigenreceptor,CAR)-T细胞免疫治疗是将人体T细胞经过基因工程手段体外修饰改造后，回输患者体内，用于治疗疾病。近几年通过优化改良，CAR-T细胞免疫治疗在血液肿瘤治疗上取得了突破性的进展,许多复发和难治性的急性白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤及浆细胞白血病患者重新获得完全缓解，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型精准靶向肿瘤免疫治疗方法1,2,3o调节性T淋巴细胞(reguIatoryTIymphocytes,Treg)以转录因子FoXP3的表达为特征，具有维持免疫耐受和预防炎症性疾病的功能4oTreg的过继治疗已被证明可以防止同种异体移植物的排斥反应并预防移植物抗宿主病5,6o这些临床前研究支持Treg作为一种极具前景的潜在治疗剂，可抑制免疫介导的不良炎症反应并促进移植和自身免疫性疾病中的免疫耐受4o有研究认为Treg细胞在肿瘤免疫中以免疫抑制作用为主7,8,实体瘤组织中大量的Treg浸润，可能也是CAR-T细胞免疫治疗在实体肿瘤中不能达到预期疗效的原因之一9o有研究指出，清除Treg有助于提高过继免疫治疗中CD8+T细胞的抗肿瘤功能10o大量T淋巴细胞功能亚群与CAR-T细胞免疫治疗疗效的相关性研究表明，记忆性T淋巴细胞的存在及高占比是维持CAR-T细胞动力学持续性的关键因素，是CAR-T细胞免疫治疗预后良好的相关因素之一，而T细胞亚群中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、NK细胞等比例与CAR-T细胞免疫治疗等疗效相关性并不明显11,但是关于Treg在CAR-T细胞免疫治疗过程中的变化以及与治疗的相关性研究未见明确报道。FOXP3是公认的Treg标记12,但是作为核内因子，在流式应用中需要经过复杂的破核膜染色操作才能被检出，且不能用于活细胞分选，具有一定局限性。近年来发现CD3÷CD4+CD25÷CD1271ow/-作为很好的胞膜指标可以帮助定量检测Treg13,14o本研究通过回顾研究接受输注CD19CD22CAR-T细胞免疫治疗的复发/难治性B细胞恶性肿瘤患者资料，分析患者回输CAR-T细胞前后多色流式细胞术动态检测的外周血CD3+CD4+CD25÷CD1271ow-Treg水平,旨在探讨Treg与临床治疗反应，患者预后的相关性。对象与方法一、对象1 .对象：收集2019年7月至2021年5月华中科技大学同济医学院附属同济医院参与临床研究接受输注CDl9/CD22CAR-T细胞治疗复发/难治性B细胞恶性肿瘤患者82例，对其中23例有Treg动态检测结果的患者进行统计学分析。其中女性8例，男性15例，中位年龄49岁(35,59)o该临床研究为开放标签、单中心和单臂临床研究，研究方案经华中科技大学同济医学院附属同济医院机构审查委员会批准，并在中国临床试验注册中心注册。根据赫尔辛基宣言，每位受试者都签署了书面知情同意书。研究对象经标准的氟达拉滨加环磷酰胺方案清淋预处理化疗后第4天序贯回输CD22和CD19CAR-T细胞进行免疫治疗。根据2014年1.Ilgano修订版的淋巴瘤疗效评价标准15对接受CD19CD22CAR-T细胞序贯输注治疗的患者进行疗效评价，回输后每个月进行一次疗效评价，半年后每2个月一次疗效评价，按随访截止期前，多次疗效评价中的最佳疗效对纳入研究的23例患者进行分组，研究对象在临床试验完成阶段最佳疗效达完全缓解(completeremission,CR)8例,部分缓解(partiaIremission,PR)7例，疾病进展或无效(noresponse,NR)8例。2 .对照组：收集2020年至2021年来自华中科技大学同济医学院附属同济医院未接受CD19CD22CAR-T细胞输注的B细胞淋巴瘤患者16名。二、方法1 .仪器与试剂：安捷伦生物有限公司的Novocyte-D3000流式细胞仪及原装配套质控微球，清洗液，冲洗液，鞘液。单克隆检测抗体及试剂购自美国BDBioscience公司,Biolegend公司及ThermoFisher公司。2 .样本采集：依据临床试验方案，淋巴细胞亚群检测采样时间点为患者回输CAR-T前048h及回输后4、7、10、14、21、30、60、90d（窗口期12d）o使用乙二胺四乙酸二钾抗凝管采集患者清晨空腹状态下静脉全血样本24ml,并充分混匀，24h内转运至实验室，用于检测外周血淋巴细胞亚群及Treg细胞。3 .白细胞计数及流式样本检测：外周血样本采用日本希森美康血液分析仪（血细胞分析仪-XN系列）进行白细胞计数，取适量全血样本（约2X106个白细胞）至流式管，依次加入荧光素标记的抗人单克隆抗体CD45V500c.CD3FITC.CD16+56PE,CD4PercP,CD8APC-Cy7.CD19PE-Cy7.CD25APC.CD127BV421,避光孵育15min后使用BD溶血素裂解红细胞IOmin,1%牛血清白蛋白溶液洗涤3遍后，300I磷酸盐缓冲液重悬，放入Novocyte-DSOOO流式细胞仪自动上样器，上机检测。4 .Treg的设门策略及数据分析：研究中使用多色流式检测患者外周血Treg细胞群，设门策略见图1,通过设门分析依次计算CD3+CD4+CD25+CD127dim-群体占CD4+T淋巴细胞，淋巴细胞及全部白细胞的比例。根据外周血白细胞计数，双平台法计算Treg细胞绝对数。TT/Allevents.T/AllGvents/POZlym/singletsoIds>3oCD4-CD*65.03%WCD4*CD8*0.15%,喙"CD4-CD8-4.47%-CD4÷CD8-30.35%CD4PerCP-HTZAllevonts/PO/IymZsinglGts/CD3*§-kSo-QCH,2>二 <HOL z5<83 QCD3+86.16%CD3FITC-H§OOCoO£Oo- 0 3ooTZAIIovents/POlymsingle<sCD3*CD3*CD4*CD3*CD4*30.44%T/Allevents/PO/IymZsingIets/CD3+图1免疫治疗后调节性T淋巴细胞（Treg）检测设门策略1A为前项散射光（FSe）/侧向散射光（SSC）二维散点图中去除死细胞及细胞碎片；IB为FSC-A/FSC-H散点图中设门去除黏连体；IC为CD45/SSC二维散点图中设门淋巴细胞群（IyrTI）;ID为再次去除黏连体；IE为设门CD3+T淋巴细胞；1F为设门CD4+及CD8+群体；1G为设门分析CD3+CD4+细胞群；IH为设门分析CD25+CD127dim-Treg群体;图片上方显示逻辑设门5 .CAR-T拷贝数检测、铁蛋白检测及血清I1.-6水平检测：采用数字定量PCR方法检测患者外周血白细胞中CAR-T拷贝数水平，采用免疫比浊法检测外周血清中铁蛋白水平，化学发光的方法检测外周血清中I1.-6表达水平。三、统计学分析数据使用Prism8Vision8.3.1及SPSS22.0进行统计学分析。对于连续型变量，2组之间的差异性比较，若服从正态分布且方差齐则采用StUdent-t检验来进行，否则用曼-惠特尼U检验。采用Cox-Stuart趋势存在性检验分析Treg水平在CAR-T回输后的变化趋势。通过方差分析比较不同疗效组别的患者Treg水平在不同时间段内是否存在差异。所有检验均为双尾，P<0.05为差异有统计学意义。结果一、患者临床特征纳入恶性B细胞肿瘤患者23例，其中弥漫大B细胞淋巴瘤（D1.BC1.）18例，伯基特淋巴瘤（BUrkitt）2例，套细胞淋巴瘤（MC1.）2例，其他类型1例。52.1%的患者（12例）在入组前IPl评分大于2分。13%的患者（3例）疾病AnnabOr分期为Ill期，87.0%的患者（20例）Annabor分期为IV期。在接受CD19CD22CAR-T细胞免疫治疗前，所有患者的中位治疗线数为3线，其中有患者最多经历了5线治疗，8例患者（34.7%）经历过自体或者异体的骨髓造血干细胞移植。对照组纳入同期未接受CAR-T细胞免疫治疗的恶性B细胞淋巴瘤患者16例，均为多线治疗后患者，均未在化疗后骨髓抑制期。其中男性9名，女性7名，中位年龄52（40,56）岁。二、Treg占比及绝对数的动态变化接受CD19CD22CAR-T细胞序贯输注的B细胞恶性肿瘤患者在清淋预处理后，回输前时间段的外周血TregCD4+T及Treg/1.ym均值明显高于未进行预处理化疗的对照组（P<0.001）,而Treg#均值明显低于对照组（P<0.001）,Treg/WBC均值在回输前与对照组差异无统计学意义（P=0.265）（表1）。表1CAR-T细胞回输前与对照组的Treg占比及绝对数（了土s）指标«(«)TregCD4(%)Treg/1.ym(%)Treg/WBC(%)Treg*(l)yjsa16733电611.91±0.900.35±0.2913.669.891320.427.9613.617.130.20±0.41181±1.52殖5.8936.531.1394.261<0,001<0.0010.265<0.001注：TrewCD4为T5占8T淞巴8胞比%Trea1.Ym为5«巴i8胞及白jQ85的比%Treg/WBC分别，Treg之力Treg的地对计数水平,叵城前灯间段为叵编CAR订分造前048h23例接受CD19CD22CAR-T细胞序贯输注的B细胞恶性肿瘤患者外周血Treg/CD4+T、Treg1.ym>Treg/WBC及Treg#水平在CAR-T细胞回输前后不同时间段内均值水平见图2o经趋势性检验分析，TregCD4+T与Treg/1.ym在回输后随时间延长均有降低趋势（P<0.001）,Treg/WBC在回输后有升高趋势（P=0.01）,Treg#趋势检验差异无统计学意义(el.x8wl（P=O.911）o8060注：、.、.为毒群值图2Treg占比及绝对数在CAR-T细胞回输前后不同时间段均值水平（2A2D分别为23例患者在CAR-T细胞回输前，回输后115d,1630d以及31d以后时间段内TregCD4+T.Treg/1.ym.Treg/WBC.Treg#的水平,回输前时间段为回输CAR-T细胞前048h,同一患者在同一时间段内如果多次检测，则取均值作为该时间段Treg水平)三、Treg水平与CAR-T细胞免疫治疗疗效及安全性(一)调节性T细胞占比及绝对数与CAR-T细胞免疫治疗最佳疗效的分析结果显示回输前时间段的TregCD4+T,Treg/1.ym.Treg/WBC水平在不同最佳疗效的患者组间差异有统计学意义(P<0.001,P<0.001,P<0.05)(图3),进一步组间方差分析显示，最佳疗效为CR组患者回输前TregCD4+T(12.87±1.93)%、Treg/1.ym(6.35±2.84)%、Treg/WBC(0.05±0.05)%均值均明显低于PR组(29.68±5.49)%(P<0.01),(21.85±2.10)%(P<0.01),0.5