2024戊二酸调节T细胞代谢和抗肿瘤免疫反应.docx

2024戊二酸调节T细胞代谢和抗肿瘤免疫反应靶向肿瘤浸润相关性T细胞是引发抗肿瘤免疫反应的有效途径。然而，如何有效地干预和调控T细胞在很大程度上仍然未知。2023年8月，日eanorMinogue等人在Naturemetabolism杂志上发表了一篇题为GlutarateregulatesTcellmetabolismandanti-tumourimmunity的论著，重点阐明了戊二酸是T细胞代谢和分化的关键调节因子，在改善T细胞免疫治疗中具有至关重要作用。现介绍如下：naturemecbolismGlutarateregulatesTcellmetabolismandanti-tumourimmunitya-9OMW9OMu,.raroF.CMntaa二vwwwnJMlr,.二二二二mi''iutwwLO11mj.hvMB*TU4Bt>>ghB,.Ov*d，“'.AW>SAlMMndroQMerM.4w*r!«««<*.MNknAMwtarte.Rtrg,1Mn-Lwrg,.OCWIIu,.ZiKvwwm,AmwmaNMtw*.Mm>.，'9jow*mm*''Chkwupd*lM戊二酸是CD8÷T细胞功能的内源性调节剂首先，研究者探究了结构上与2HG（2羟戊二酸）相关的化合物是否可以增加CD8÷T细胞的Tcm（中央记忆T细胞）群体。为了进行该分析，研究者鉴定了2HG的19种结构类似物。研究者使用了大多数所用化合物的酯化形式，以增加效力和细胞内转运。在这些试验中，S-2HG的辛酯形式用作阳性对照。在所测定的19种测试化合物中，仅戊二酸二乙酯（DEG）显著增加TCM样群体的丰度。DEG是代谢产物谷氨酸（戊二酸盐）的二酯化形式。研究者发现单独用戊二酸处理也能够在CD8+T细胞的活化和分化期间增加TCM群体。虽然外源性戊二酸可以被T细胞吸收，但酯化形式的戊二酸在调节CD8+T细胞分化方面更有效。为了证实外源性使用DEG导致细胞内戊二酸水平增加，研究者对13C5标记的DEG进行同位素示踪。示踪显示，DEG在摄取后非常迅速地转化为细胞内戊二酸。戊二酸是色氨酸和赖氨酸降解的产物，靠近犬尿氨酸途径的末端。当前只有非常有限的文献涉及免疫细胞中的戊二酸。因此，研究者试图确定天然和活化的CD8÷T细胞中存在的戊二酸的量。使用质谱法测定CD8+T细胞中内源性戊二酸的细胞内水平，结果显示戊二酸水平在T细胞活化后显著增加。T细胞活化会极大地改变T细胞代谢，这种代谢变化的主要驱动因素是缺氧诱导因子1-（HIF-1）转录因子。研究者测定了HlF-Ia三予生型和HIF-Ie（敲除型小鼠CD8÷T细胞中的戊二酸水平，发现在野生型细胞中观察到的戊二酸增加在HlF-IC（敲除细胞中几乎完全不存在。这一发现表明HlF-I潟录因子对调节T细胞戊二酸水平至关重要。同样地,与在21%氧水平下培养T细胞相比，在1%氧水平下培养T细胞24小时使戊二酸水平增加约两倍。研究者还发现用DEG处理的CD8÷T细胞和用ShGCDH处理的CD8÷T细胞都显示出细胞毒性效应分子颗粒酶B（GZMB）表达的增加。根据对DEG改变T细胞分化观察到的结果，研究者检查了处理细胞中的多个耗竭相关标记，在DEG处理10天后的人CD8÷T细胞培养物中，发现了TOX（-种已知协调耗竭的转录因子）以及耗竭标记TIM3和LAG30相反，通过过表达GCDH（使用GCDH过表达载体）降低戊二酸水平导致TOX、TIM3和LAG3表达增加。综上所述，这些数据表明戊二酸可以改变CD8÷T细胞分化。a S=g 1.80。oeu28dROoOl80 - 0.0O3960- 40- 20-O-1 £ 一 IgAede£ m YCO62LhCD44N匚ECD 96 7 9 6 Oog式86英出£宠Test compound IDMouseCell growth6=8JBqo>OJQqUlnUSQ0.80 -1.000 -9 02-0ox> OaaOe OeoOo ® 0800 .SOQO A9 9950$ aso 80E> 200 98so I99fOoO o $8S3 8 sod >B8Test compound IDGCDH石 q£nu9 AdouEd8.0-IC 12s2oS=8 9.0- Ic OWO3-O10.0 - ：0°Oe &OOO J 谿 .o TOa 4.0 -I * 2.0-OWT Htf-Ia knockoutPercentage O2No SL06UQlP POJ LdsZGO)DG500M ShGCDH GCDH 0vc9xpc0MdQ GCDH OVOfOiprQMOd 500 M DEG0 3> &UB£ pJzw Z601图1戊二酸是CD8+T细胞功能的内源性调节剂戊二酸是KGDDs（酮戊二酸依赖性双加氧酶）的抑制剂戊二酸在结构上与2HG、富马酸、琥珀酸和C(KG相似，因此是C(KGDDS的候选竞争性抑制剂。为了确定这种情况是否属实，研究者重点研究了OKGDS的三个亚家族：甲基胞口密D定双加氧酶(TETS),缺氧诱导因子脯氨基4-羟基酶(HlF-P4Hs)和组蛋白赖氨酸去甲基酶(KDM)。在无细胞酶活性测定中，戊二酸盐以1.5mM的半数最大抑制浓度(IC50)抑制重组TET2,并且这种抑制作用与O(KG具有竞争性。然而，DEG在无细胞试验中不抑制TET2,这进一步证明了研究者观察到的结果是由于游离戊二酸所致。在验证戊二酸对HIF-P4H的抑制作用时，研究者使用了由Gal4响应元件驱动的荧光素酶报告基因。研究者发现DEG可以抑制该模型系统中的细胞HIF-P4H-I活性。当向培养物中加入浓度递增的C(KG时，戊二酸对HIF-P4H-1的抑制作用降低，表明与TET2抑制作用一样,戊二酸以aKG竞争性方式抑制HIF-P4H-1oHIF-P4H-1的这种抑制与DEG处理7天的CD8÷T细胞中几种HIF靶基因的表达增加相关。为了确定戊二酸是否也抑制KDM酶，用DEG培养CD8+T细胞7天，并确定许多组蛋白3(H3)赖氨酸残基的甲基化状态。CD8+T细胞的DEG处理增加了H3K9的二甲基化和三甲基化以及H3K27的三甲基化。H3K9和H3K27甲基化的增加通过添加等摩尔量的QtKGd得以消除,而H3K9me2水平并没有随着C(KG的添加而降低。由于KDM4C和KDM6A分别负责H3K9me3和H3K27me3的去甲基化，对这些酶进行了无细胞酶活性测定，结果发现戊二酸抑制KDM4C的IC50为ImM,抑制KDM6A的IC50为0.6mMo正如预期的那样,在无细胞测定中，单独的DEG不能抑制KDM4C活性。这些试验数据表明，戊二酸至少是三种特定KGDD的抑制剂，即TET2、HIF-P4H-1和KDM4C/6A酶。这种抑制与细胞基因表达和表观遗传谱的多种变化相关，包括特定的HIF靶标、组蛋白甲基化增加和DNA去甲基化减少。a uoqzu 一6eluaodUo 三 qzu 一6eu28d。堂DEG (uM)uo,q-qu- B62U6。Bdd uo-=qzu 一BsussdHIF-PH (ce(l*based assay)HIFPHH3 methylation9 H3K27me3CHuoud× ,soaCeo-s*cEHNO- SSQX U 亘 oaZeolsox 020x Z£6XCH EauJneHDEG - ÷ - ÷H3K27me31 15H3 15eH'uosssd× coJd、60一Uo5qxu 一 6BCa QJaduoqw 86sua>2d图2戊二酸是KG依赖性反应的抑制剂PDH的戊二酰化破坏脂酰化戊二酰化是最近发现的一种翻译后修饰（PTM）,它使用戊二酸的CoA形式（戊二酰CoA）作为底物。该反应能够以酶促和非酶促反应的方式发生，而脱戊二酰化被认为是由SIRT5介导。最近，对小鼠肝脏和大脑的研究表明，戊二酰化可以修饰一系列蛋白质。鉴于前期预实验观察到CD8+T细胞中戊二酸水平的波动，研究者希望确定戊二酸化是否也发生在CD8+T细胞中。首先，研究者通过用泛赖氨酸戊二酰化（K-戊二酰化）抗体进行蛋白质印迹分析来确定这一点。研究者发现，蛋白质戊二酰化在CD8÷T细胞中是清楚可检测的。在这些蛋白质印迹测定中，研究者观察到相对少量的蛋白质便具有戊二酰化的显著变化。该测定中一种值得注意的是约70kDa的蛋白质。该蛋白也是T细胞受缺氧和暴露于DEG影响最大的部分。研究者用K-戊二酰化抗体进行了免疫沉淀（IP）测定。三种非细胞骨架/组蛋白被阳性鉴定：（1）2-酮戊二酸脱氢酶（OGDH）（2）二氢硫辛酰赖氨酸残基乙酰转移酶（DLAT）（也称为PDHc的E2亚基（PDHE2）（3）PDHE1组分亚基（PDHEIB）。随后，通过反向IP确认戊二酰化靶标，其中使用靶抗体进行IP,然后用K-戊二酰化抗体探测所得到的蛋白质印迹。在研究者的测定中，仅PDHE2亚基可被检测且明确地戊二酰化。IP和随后用K-戊二酰化抗体进行的蛋白质印迹分析显示，在该系统中OGDH未被可检测地戊二酰化。因此，通过质谱鉴定和反向IP确认，PDHE2亚基（67kDa）是唯一的戊二酰化靶标。PDHc催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A,从而连接糖酵解和三竣酸（TCA）循环。PDHc由三种催化酶的多个拷贝组成：PDH（日）二氢硫辛酰胺乙酰转移酶（PDHE2）而二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）（E3）。E2亚基是PDHc的功能核心，并通过其硫辛酰基结构域的循环还原和氧化提供催化活性，在PDHc中的各个酶的活性位点之间引导底物。多结构域E2亚基由C-末端催化结构域、外周亚基结合结构域和1-3个硫辛酰基结构域的N-末端组成。硫辛酰结构域内含有一个与赖氨酸残基共价连接的硫辛酸，该硫辛酸对于PDHC催化活性是必需的。研究者用DEG处理人CD8÷T细胞，观察到PDHE2硫辛酸水平降低。从HeLa细胞免疫沉淀的PDHE2蛋白质组学分析结果来看，DEG处理降低了硫辛酰K259的水平，同时增加了戊二酰-硫辛酰K259o除了在K259上观察到的戊二酰化位点外，蛋白质组学还发现另外两个PDHE2赖氨酸残基连接有戊二酰基团，即K396和K482这些数据说明戊二酰化发生在CD8+T细胞中。这种戊二酰化状态在活化后发生改变，并将PDHE2鉴定为戊二酰化靶标,同时提供戊二酰化破坏正常PDHc脂酰化的证据，从而能够改变复合物的催化活性。图3PDH的戊二酰化破坏脂酰化戊二酸调节代谢状态如上所述，PDHC将糖酵解与TCA循环联系起来。因此，研究者假设戊二酰化可能会降低PDHc的酶活性，从而增加糖酵解速率。为了测试这一点，研究者对CD8÷T细胞裂解物进行了PDHc的直接酶活性测定，发现急性（30分钟）和慢性（7天）暴露于DEG均导致PDHc活性降低。在具有部分沉默的GCDH的CD8+T细胞中也观察到降低的PDHc活性，并因此增加内源性戊二酸水平。正如预期的那样，PDHc活性的这种降低导致基础细胞外酸化速率（ECAR）的增加，因为丙酮酸被乳酸脱氢酶代谢形成乳酸。为了进一步探索所观察到的戊二酸诱导的PDHC活性降低的代谢后果，研究者进行了糖酵解应激试验（GST）。通过用DEG处理CD8+T细