western-blot实验操作步骤.docx

western-blot实验操作步骤Western,也称WeSternblotxWesternblottingsWeStern印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。可按照以下步骤操作。1.收集蛋白样品(PrOteinsamplepreparation)使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。2.电泳(EIeCtroPhoreSiS)SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶(分离胶及浓缩胶)可以参考一些文献资料进行配制(2)样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，100oC或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。(3)上样与电泳(1)冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。(2)电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在浸酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V,高电压可以设置在120V左右。(3)为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V,然后设定定时时间为90-120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时浸酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。3 .转膜(TranSfer)(1)我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用银子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA,转膜时间为30-60分钟。也可以在15-2OmA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。(2)在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。4 .圭寸闭(BlOCking)(1)转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。(2)用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在4封闭过夜。5 .一抗孵育(Primaryantibodyincubation)(1)参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。(2)用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4。C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4。C缓慢摇动孵育过夜。(3)回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液,洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。6 .二抗孵育(SeCOndaryantibodyinucubation)(1)参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。(2)用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4。(:在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。(3)回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。7 .蛋白检测(DeteCtionofproteins)(1)参考相关说明书，可使用英格恩的Enlight等超敏ECL发光液来检测蛋白。(2)洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。8 .膜的重复利用(Membranerecovery)如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜