流式细胞相关操作.docx
1型糖尿病药物疗效的流式细胞仪操作原理：体内各T淋巴细胞亚群相互作用维持着机体的正常免疫功能,在保护机体免受各种病原体感染的过程中起着重要的作用。CD3、CD4、CD8均为随T细胞分化过程出现的抗原故又称T细胞分化抗原。CD3抗原分布于所有成熟的T细胞膜上,是所有的T细胞都具有的分化抗原,也是鉴定外周血中T细胞的最好标志。CD4和CD8亚群是一对相互排斥的分化抗原,正常人CD4+T细胞约占T细胞总数的65%,可分为Thl和Th2两个亚群。CD4+多为辅助性T细胞(Th),通常是识别抗原递呈细胞外表与MHCH类分子结合的抗原,具有辅助体液免疫和细胞免疫的功能。Th1、Th2细胞依赖它们产生的细胞因子还有相互调节和制约作用。CD8分子多由抑制性T细胞(TS)和细胞毒性T细胞(CTL)表达,是鉴定此两种细胞亚群的主要标志。Ts细胞在免疫应答中主要起抑制性调节作用,通过抑制Th细胞的活性,抑制抗体形成和细胞介导免疫应答的作用。CTL细胞具有细胞毒活性可以杀伤带有抗原的靶细胞。CD4/CD8正常机体为1.5以上。一般认为CD4+T细胞减少,CD4/CD8下降,意味着机体免疫功能低下。本实验主要观察小鼠脾脏中的ThLTh2、Treg>Thl7细胞。主要选取的抗体有：CD3,CD4,CD8,Foxp3+,RoRt+,Tbet卡等。流式细胞分析T细胞亚型处死各组小鼠，每组3只，取脾脏，遵照相关流式操作流程处理脾细胞。，封闭液来自正常小鼠或大鼠血清表2.2，每组检测8个不同的指标，分别设为空白对照管、CD4+管、CD4+CD25+WvFoxp3+单标管、Foxp3+CD4+CD25+WxRoRt+CD4+WT-bet+CD4+tfGATA-3+CD4+W表2.3。Table2.1Propertiesofantibodiesusedinflowcytometricanalysis.HostIsotypeReactivityConjugateCat.No.Anti-CD4RatIgG2b,kappaMouseAPC-eFluor78047-0041-80Anti-CD25RatIgG1,lambdaMousePE12-0251-81Anti-Foxp3RatIgG2a,kappaMouseAlexaFluor48853-5773-80Anti-RoRytRatIgG1,kappaMousePE12-6981-80Anli-T-betMouseIgG1,kappaMousePE12-5825-80Anti-GATA-3RatIgG2b,kappaHuman,MousePerCP-eFluor7IO46-9966-41AllsixantibodieswerepurchasedfromeBioscience.Table2.2ScrumandantibodiesusedforstainingcorrespondingTcellssubsets.BlockingforFCRCel!-surfaceantibodyBlockingfornuclearreceptorNuclearantibodyTregsRatserumCD4,CD25RatserumFoxp3Thl7RatserumCD4RatserumRoRtThlRatserumCD4MouseserumT-beiTh2RatserumCD4RatserumGATA-3Table2.3Subjectsandantibodiesintheminvestigatedinthisstudy.设定管/组需加抗体空白对照管一CD，管+CD4CD4+CD25+W+CD4vCD25Foxp3卡单标管+Foxp3Foxp3+CD4+CD25+管+Foxp3、CD4、CD25RORyt+CD4+管+CD4、RoRytT-bet+CD4+管+CD4xrFbetGATA-3+/CD4+管+CD4xGATA-3详细步骤如下：1、获取脾脏，参加5-1OmLeBioSCience®流式染色缓冲液(eBioscienceCat.No.00-4222),使用3mL注射器注射心研磨组织。2、收集经研磨获得的细胞悬液，共IomL,过滤消除细胞团块和碎片至离心管中。3、裂解小鼠脾脏红细胞,通常一个脾脏使用5mL裂解液,裂解5分钟左右,最长不超15min0裂解至溶液透亮后参加2倍以上体积的PBS,终止裂解。4,100Orpm离心5min,PBS洗涤一次。4、4,100OrPm离心5min,用少量染色缓冲液重悬并计数和活力分析。5、4°C,IOoorPm离心5min,用染色缓冲液调整细胞浓度为IxlO7/mL。6、封闭FCR介导的非特异性反响:染色之前参加适量的大鼠血清,2-8°C或室温孵育20min°7、等分细胞悬液，W50uL（2×105-108）,再补加50UL染色液。8、按照抗体说明书参加适量抗体，轻弹混匀。CD4抗体溶液和CD25抗体溶液参加剂量都为lLo9、避光，4°C,30minoIOv用2mL管的流式染色液洗，室温IooorPm离心5min,重复两遍。IK最后一次离心后，离心完全弃上清。12、力口ImLFoxp3FiXatiOnZpeiTneabilization工作液，涡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30-60min小鼠样品最长可以四度固定18小时。13、每管力口ZmLlxpermeabilizationbuffero14、100orPm离心5min,弃上清。15、加100uLIxpermeabilizationbuffer重悬细胞后，参加2uL2%的大鼠/小鼠血清，室温孵育15mi11oFoXP3、RORYt、GATA-3抗体染色用大鼠血清封闭；T-bet抗体染色用小鼠血清封闭。16、封闭液无需洗去，直接参加稀释好的荧光标记核因子抗体用PermeabilizationBuffer工作液进行稀释20uL,室温避光孵育至少30mino本实验中FoXP3、RORYKT-bet、GATA-3抗体分别取05LIgL、2.5L5L原液。17、2mL1Xpermeabilizationbuffer洗一次，1OOOrpm室温离心5min,弃上清。18、加2mL流式染色液，100OrPm室温离心5min,弃上清。19、适量流式染色液重悬，即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。抗体价格表达科为代理BiOIedgen的价目表：BD的价格最近有优惠活动，打到4.5折。具体价格以BD官网价格（）为主，比方CD4的抗体，25UL折后价格为415元。金亮老师那边主要用BD的。eBioscience公司），上届师兄主要用的这个，价格还在询问中，目前，师兄没有回复。
