高通量测序原理.ppt

Illumina Solexa 合成测序基本原理Solexa技术介绍 Solexa 技术最早由两位剑桥大学的化学家创立，利用专利核心技术“DNA 簇”和“可逆性末端终结”，达成自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。Solexa 的基本原理的基本原理扩增“桥桥”结结构构单链引物单链引物DNA簇簇单分子克隆1000 DNA片段片段per 1 m“DNA簇簇”1000“DNA簇簇”per 100 m square40 million clusters per experiment准备准备DNA片段片段两端接上两端接上 adapters将将DNA片段通过片段通过adapter锚定在芯片上锚定在芯片上循环扩增循环扩增DNA片段成片段成“DNA簇簇”20 micronsSequence检测可逆终止反应Reversible Terminator ChemistryO PPPHNNOO荧光基团3保护基团Next cycle掺入检测去保护基团 去荧光基团ODNAHNNOO3O5游离3末端XOH4种标记过的核苷酸Sequencing-by-Synthesis(SBS)5GTCAGTCAGTCAGT35CAGTCATCACCTAGCGTA掺入一个碱基掺入一个碱基Cycle 1:加入反应体系加入反应体系移除其他未掺入的核苷酸移除其他未掺入的核苷酸信号检测信号检测Cycle 2-n:加入反应体系，循环加入反应体系，循环cycle 11、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可以被去除的保护基团2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团和荧光基团，进行下一轮测序反应123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T 根据每个根据每个DNA簇每轮反应读取的荧光信号序列，簇每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的转换成相应的DNA序列序列通过荧光信号分析核苷酸序列通过荧光信号分析核苷酸序列优缺点 高度自动化的系统 读取片段多，适合进行大量小片段的测序，如microRNA profiling 基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降低，信号衰减，读取序列较短，给从头测序（de novo sequencing）拼接带来困难技术特色突出表现 每张测序芯片有8 个通道，每个通道可单独运行一个样品，也可以把多个样品混合在一起检测；一次实验可读取大于15 亿个碱基/芯片；无需建库，自动化样品制备，简单；实验费用低，测序成本为传统测序方法的1/100；样本使用效率极高，所以对少量样本也可以极灵敏精确地检测。应用 测序与重测序 表达谱分析 Small RNA鉴定与定量 SNP检测 DNA甲基化分析