基于细胞焦亡通路探讨除湿外用颗粒对特应性皮炎小鼠的改善作用.docx

基于细胞焦亡通路探讨除湿外用颗粒对特应性皮炎小鼠的改善作用孙野L赵小强L王丹杰L汪军彭勇2,鳍(1,复旦大学基础医学院中西医结合学系，上海200032；2.上海市嘉定区中医医院皮肤科，上海201899；3.上海市嘉定区中医医院药剂科，上海201899)摘要目的:探讨除湿外用颗粒(CSWYG)对理酮诱导的特应性皮炎(AD)小鼠模型的药效及潜在作用机制.方法:将小鼠按随机区组分为对照组、模型组和CSWYG治疗组，每组78只.观测小鼠皮肤皮损、搔抓次数；利用苏木素-伊红(HE)染色观察皮肤病理改变，流式细胞术检测脾脏CD4/CD8,T淋巴细胞比值，ELISA检测血清中免疫球蛋白E(IgE),L-4,以及组织中IL-邛、IL-18、IL-4的蛋白表达变化；Westernblot检测皮损组织中GSDMD的表达和活化，qRT-PCR检测皮损组织中炎症因子儿邛、小78、和GSdmdmRNA表达水平。结果:与模型组相比，CSWYG治疗组小战皮肤肿胀、鳞屑及瘙痒均有不同程度减轻，皮肤厚度降低,血清中IgE及IL-4含量减少，脾脏CD4÷CD8+T淋巴细胞比值降低，皮损中IL-邛、IL-18、IL-4和GSDMD的mRNA和蛋白表达水平明显降低，皮损组织中GSDMD蛋白剪切减少.结论:CSWYG能够通过抑制皮肤GS-DMD细胞焦亡信号通路调节局部炎症反应及AD小鼠免疫功能而发挥治疗作用。关键词)除湿外用颗粒；侬酮；特应性皮炎；细胞焦亡；免疫调节中图分类号R275.9文献标识码A文章编号001-5213(2023)19-2148-06DOk10.13286/j.1001-5213.2023.19.04ExploringthetherapeuticeffectsofChushiWaiyongGranulesonoxazolone-inducedatopicdermatitisinmicebasedonpyroptosispathwaySUNYe1,ZHAOXiaoqiang1,WANGDanjie',WANGJunSPENGYong2,QIANFang3(1.DepartmentofIntegrativeMedicineandNeurobiology，SchoolofBasicMedicalSciences，FudanUniversity,Shanghai200032China;2.DepartmentofDermatology,JiadingDistrictHospitalofTraditionalChineseMedidne,Shanghai201899,China；3.DepartmentofPharmacy,JiadingDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicine.Shanghai201899,China)ABSTRACTOBJECTIVEToinvestigatethetherapeuticeffectsandmechanismofChushiWaiyongGranules(CSWYG)onanoxazolone-inducedatopicdermatitis(AD)mousemodel.METHODSThemicewereallocatedintontrolgroup,modelgroup,andCSWYGtreatmentgroupusingrandomizedblockdesign，with7to8miceineachgroup.Theskinlesionsandscratchingbehaviorwereevaluated,andskinpathologicalchangeswereassessedusinghemato×ylin-eosin(HE)staining.FlowcytometrywasusedtoassesstheCD4"CD8'Tlymphocyteratioinspleen.ELISAwasusedtomeasurethelevelsofimmunoglobulinE(IgE)andIL-4inserum，aswellastheexpressionofIL-i,IL-18andIL-4inskin.TheexpressionofGSDMDinskinlesionswasdetectedusingWesternblot.ThemRNAexpressionofinflammatoryfactorssuchasll-i,11-18,/-4andGsdmdmRNAwasdetectedbyqRT-PCRassay.RESULTSComparedwiththoseinthemodelgroupthemiceintheCSWYGtreatmentgroupshowedlessskinlesionssuchasswelling,erythemaandscaling.Theyalsodisplayeddecreasedscratchingbehavior,decreasedinfiltrationofinflammatorycells，anddecreasedthicknessofepidermis.Additionally，thelevelsofIgEandIL-4inserumwerelowerintheCSWYGtreatmentgroup.TheCD4*CD8,Tlymphocyteratioinspleenwasalsolower.Furthermore,therewerelowermRNAandproteinexpressionlevelsofIL-i,IL-18IL-4andGSDMD,anddecreasedcleavageofGSDMDinskinlesions.CONCLUSIONCSWYGtreatmentinhibitsGSDMD-mediatedcellpyroptosissignalingpathway,indicatingitspotentialasatherapeuticagentforADbyregulatinglocalinflammatoryresponseandimmunefunction.KEYWORDS:ChushiWaiyongGranules;oxazolone;atopicdermatitis;pyroptosis;immunoregulation特应性皮炎（atopicdermatitis,AD）是一种常见的慢性炎症性皮肤病，以表皮增生、复发性湿疹伴剧烈瘙痒为特征。AD的病因和发病机制复杂，涉及遗传因素、免疫失调和炎症、皮肤屏障功能缺陷以及神经心理学因素,影响全球10%20%的儿童和3%10%的成人，是全球皮肤疾病的主要疾病负担之一。此病对患者的身体、情绪和社交等诸多方面都会产生负面影响O现代医学大多采用对症、非特异性抗炎或免疫抑制治疗，局部应用皮质类固醇配合润肤剂是主要基金项目国家自然科学基金项目（编号:82074538）;上海市嘉定区中医重点学科（专科）建设项目（编号:202C）-JDZYYZDXK-01）；复旦大学上海医学院卿枫学者项目（编号:QF2234）作者简介孙野，男，本科，研究方向:中西医结合皮肤病诊治通信作者钱芳，女，硕士,主任药师，研究方向:临床药学和药事管理治疗方法。但是，连续或者长期使用会导致应用局部出现皮肤萎缩、毛细血管扩张、紫瘢、皮纹和面部座疮样变化，不宜长期大面积使用阴。为更好地改善AD患者的病情，越来越多的学者开始研究中药及其配伍对AD的治疗作用，期望寻找疗效好、副作用小、经济效益好的治疗药物。除湿外用颗粒（ChushiWaiyongGranules,CSWYG）是上海市嘉定区中医医院自制制剂（制剂备案号：沪药制备字Z20200034000）,由外科正宗卷四的中医外科名方“蛇床子汤”的基础上化裁而来。该制剂临床效果确切，能有效改善过敏性皮炎、神经性皮炎等炎症性皮肤病患者皮肤损伤，控制瘙痒，但其治疗AD的疗效及作用靶点尚不明确。本实验旨在探讨CSWYG对嗯嗖酮诱导的AD小鼠的干预作用及抗炎和免疫调节机制，为CSwYG在临床上用于治疗AD等炎性皮肤病提供实验依据。1材料1. 1仪器OCUsIl40数字切片扫描仪（芬兰Grundium公司）;7300-PIUS实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）;BDFACS流式细胞仪（美国BD公司）。1.2 药物与试剂坐酮（oxazolone,oxa）购自美国Sigma公司，溶于丙酮-玉米油（4:1）混合港i,分别配制含2%和0.5%喙嗖酮致敏液，4节避光保存。CSWYG自制制剂含苦参、黄柏、地肤子、蛇床子、马齿览律草、一枝黄花.透§草花椒、红花、白研成分，由上海万仕诚药业有限公司生产（批号202108010603,20g袋,相当于中药饮片205g）。用44.44mL开水冲泡20gCSWYG,根据人的剂量（0.5125g.mL一生药）将浓度换算成小鼠剂量配制外用洗液（原液生药浓度为4.6g.mL-】）,免疫球蛋白E（IgE）、白细胞介奏4（L-4）购自美国Abcam公司；逆转录试剂盒（美国Promega公司），PCR试剂盒（日本Takara公司）,GasderminD（GSDMD）一抗（美国CellSignaling公司）流式细胞术荧光标记抗体APCCyanine7-CD3,FITC-CD4,Per-CPcyanine5.5-CD8（BioIegend公司）o1.3 实验动物清洁级雄性C57BL/6小鼠（68周龄），由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供合格证号：SCXK（沪）2017-0005本实续程及方案符合复旦大学基础医学院伦理审查标准（批件号:20200306）37）。2方法2. 1小鼠特应性皮炎（AD）模型建立、分组及给药采用随机区组分组将小鼠分为3组，每组78只，分别为对照组、模型组、CSWYG治疗组（简称治疗组）。实验前1天小鼠腹部和右侧颈背部剃毛，面积约2cm×2cm。参照造模方法复制AD小鼠模型：第0天小鼠腹部皮肤局部涂抹2%oxa200PL致敏；5d后，小鼠右侧颈背部（右耳+背部）涂抹50L0.5%oxa激发，隔天一次，持续6次，激发次日记录Ih瘙痒行为对照组小鼠使用相同剂量的溶剂。实验激发阶段开始给予CSWYG药物干预，每天将CSWYG洗液200L涂抹于致敏处湿敷30min,遇激发日时激发2h后给予中药治疗。实验流程见图LKOM（Ob405OmOMOxa0Om0,SOad9Oa.“复SX»1*DOD506D7DMDlODUD12D23014DlSDlS*Ililt除外国粒爱余力力fJ>ftA*图1AD小鼠模型制备和CSWYG治疗流程图FiglPreparationofmousemodelofatopicdermatitisandtreatmentprocesswithCSWYG2.2小鼠背部皮肤厚度变化致敏前后用数字游标卡尺测量各组小鼠背部表皮厚度（mm）,隔天测量一次。2.3小鼠搔抓次数记录和评分每日均于13:00-16:00时将小鼠放入独立分隔的塑料检测盒中，观察小鼠用后肢搔抓激发部位次数，每举起后肢接触并抓挠背部皮肤到离开皮肤为1次搔抓，用DV记录Ih后进行双盲分析。2.4ELlSA检测血清IgE、IL-4和组织IL-I0、IL-18、IL-4含量末次激发后次日对各组小鼠摘眼球取血，离心取血清,置于一70节冰箱保存。取小鼠皮肤组织匀浆提取总蛋白，根据ELlSA试剂盒说明书检测血清IgE和IL-4,以及皮肤组织中IL-Ib、IL18、IL-4的含量。2.5苏木精-伊红（HE）染色检测小鼠皮肤组织病理变化收集各组小鼠背部皮肤组织，一部分置于4%多聚甲醛