猪去氧胆酸对脂肪变性肝细胞活性的影响及其机制.docx

脂肪性肝病l：10.1244azJCH240212猪去氧胆酸对脂肪变性肝细胞活性的影响及其机制汪远远他,2,邹艳，刘朝霞3,2,阳学风1南华大学附属南华医院a.消化内科，b.手足外科，湖南衡阳4210022湖南省代谢相关脂肪性肝病临床研究中心，湖南衡阳421002通信作者：阳学风，yxf009988(ORCID:0000-0002-3470-0350)摘要：目的探讨猪去氧A旦酸(HDCA)在代谢相沟旨肪性肝病(MAFLD)发展中的作用及机制，为击步阐明MAFLD的发病机制提供新的理论依据.方法L02肝细胞作为实验细胞，利用棕植)酸诱导L02细胞发到旨肪变性.采用FXRSiRNA干扰翩沐，构建FXR仍表的肝细胞株。CCK8实验检测HDCA在不同浓度(0、100、200、300、400moVL)和时间(12、24、36、48h)对L02脂影响HiiqRTFCR检测法国X哪(FXR)、增蒯胞(PCNA八醐蛋白D1(CyclinD1)、磷月享-3缄(PI3K)码白僦B(AKT)mRNA辘;WesternBlot撷。FXRxCydinD1、PCNAPI3Kp-PI3K、AKT和P-AKT蛋白表达。计量资料服从正态分布且方差齐时多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用TukeyHSD检验；服从正态分布但方差不齐时采用Welch方差分析，进一步两两匕限采用Games-Howell检验。两组间比较采用成组f检验。结果CCK8检测结果显示，300molLHDCA处理的L02细胞和脂肪变性肝细胞活性明显下降(P值均0.05)IqRT-PCR检测结果显示，FXRmRNA表达增强，PCNAxCyclinD1、PI3KxAKT的mRNA表达下降，差异均有统计学意义(产值均0.05)WesternBtot检测结果显示，FXR蛋白表达明显上升(P0.05);干扰L02细胞FXR的表达后，PCNA.PI3KxP-PI3K、AKT和P-AKT的蛋白表达均明显增力(产值均0.05).结论HDCA通过上调FXR表达十制PI3K/AKT信号通路，从而造成脂肪变性肝细胞活性下降。关键词：代谢相关脂肪性肝病；猪去氧胆酸；法尼醇X受体基金项目：湖南省教育厅一般项目(20C1586)；湖南省科技创新计划项目(2020SK51910,2021SK51902)EffectofhyodeoxycholicacidontheactivityofsteatosishepatocytesanditsmechanismWANGYuanyuan1a2,ZOUYan1b,LIUZhaoxiala,2,YANGXuefengla,2.(1.a.DepartmentofGastroenterology,b.DepartmentofHandandFootSurgery,NanhuaHospitalAffiliatedtoUniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421002,China;2.HunanProvincialClinicalResearchCenterforMetabolicAssociatedFattyLiverDisease,Hengyang,Hunan4210021China)Correspondingauthor:YANGXuefeng,yxf009988(ORCID:0000-0002-3470-0350)Abstract:ObjectiveToinvestigatetheroleandmechanismofhyodeoxycholicacid(HDCA)intheprogressionofmetabolicassociatedfattyliverdisease(MAFLD),andtoprovideanewtheoreticalbasisforfurtherclarifyingthepathogenesisofMAFLD.MethodsL02hepatocyteswereusedasexperimentalCenS,andpalmiticaddwasusedtoindusteatosisinL02cells.ThefamesoidXreceptor(FXR)siRNAinterferenchaintechniquewasusedtoconstructahepatocytecelllinewithlowFXRexpressi.CCK8assaywasusedtoobservetheeffectofHDCAonL02steatosishepatocytesatCifferentconcentrations(0,100,200,300,and400mdL)andtimepoints(12,24,36,and48hours).ThemethodofqRT-PCRwasusedtomeasurethemRNAexpressionlevelsofFXR,proliferatingcelnudearantigen(PCNA),CydinD1,phosphatidylinositol3-kinase(PI3K),andproteinkinase-B(AKT),andWesternWotwasusedtomeasuretheproteinexpressionlevelsofFXR,CydinD1fPCNA,PBK,phosphorylatedPI3K(p-PI3K),AKT,andphosphoryiated(p-AKT).Aone-wayanalysisofvarianwasusedforcomparisorofncxmaJlydistributedntinuousdatawithhomogeneityofvarianbetweenmultplegroups,andtheTukeyHSDtestwasusedforfurthercomparisbetweentwogroups;theWelchanalysisofvariancewasusedforcomparisofncnaiydistributedntinusdataWrthheterogeneityofvariancebetweenmultiplegroups,andtheGames-Howelltestwasusedforfurthercomparisbetweentwogroups.Theindependent-samplesttestwasusedforcomparisonbetweentwogroupsResultsCCK8assayshowedasignificantreductioninteviabilityofL02cellsandsteatosishepatocytestreatedby300mo(LHDCA(P<0.05),andqRT-PCRshowedaSignifiCantincreaseinthemRNAexpressionlevelofFXRandsignificantreductionsinthemRNAexpressionlevelsofPCNA,CydinDl,PBK,andAK(allP<Q05).WestanblotshowedasignificantincreaseintheproteinexpressilevelofFRX(P<0,05),andafterinterferenceofFXRexpressioninL02cells,thereweresignificantincreasesintheproteinexpressionlevelsfPCNA,PBK,p-PI3K,AKT,andp-AKT(allP<0.05).CondusionHDCAinhibitsthePI3KAKTsignalingpathwaybyUpregulatingFXRexpression,therebyinducingareductionintheviabilityofsteatosishepatocytes.Keywords:Metabolism-AssociatedFattyLiverDisease;Hyod×ycholicAdd;FamesoidXReceptorResearchfunding:GeneralProjectofHunanProvincialEducationDepartment(20C1586);HunanProvincialScienceandTechnologyInnovationProgramProject(2020SK51910,2021SK51902)目前，代湘沟旨雌肝病(metabolism-associatedfattyliverdiseasefMAFLD)已成为我国慢性肝病的第一大原因，患病率高达30%,且预计仍会进一步升高m。MAFLD与代谢性疾病发病密切相关，如肥胖、高血压、2型糖尿病以及心血管疾病等12)。脂质代谢异常是MAFLD的关键问题之一【3肝脏的脂肪酸大多来自脂肪中甘油三酯分解，通过血液循环至肝脏吸收41o胆汁酸由胆固醇代谢产生，可以通过激活肝脏内的法尼醇X受体(farnesoidXreceptor,FXR),调节脂肪酸合成、氧化和运输等过程，从而影响脂肪代谢斗。笔者预实验通过质谱分析发现猪去氧胆酸(hyodeoxycholicacid,HDCA)在MAFLD患者的血液和粪便样本中含量明显高于健康人，但HDCA在MAFLD发病中的作用及机制尚不清楚本课题组采用棕楣酸(palmiticacid,PA)诱导L02细胞构幽旨肪变性肝细胞模型，分析HDCA对脂肪变性肝细胞活性的影响；并构建FXR低表达肝细胞株，研究HDCA是否通过FXR-PBK/AKT途径对脂肪变性肝细胞的活性发挥作用，从而探讨HDCA在MAFLD发生发展中的作用及其机制，为MAFLD的预防和治疗提供新途径。1材料与方法1.1细胞培养L02细胞(HL7702)购自上海佰晔生物科技公司。DMEM高糖完全培养基包含10%胎牛血清(FBS)和1%青链霉素混合液(XlOo),L02细胞接种于25cm2底面积的培养瓶中，置于37、5%CO2的细胞培养箱内培养0.2mmol/L的PA诱导L02细蒯旨肪变性。1.2PA的配置取25.642mgPA加入至ImL无水乙醇中水浴加热，配得浓度为100mmol/L的PA溶液。另取50mg无三肪酸牛血清白蛋白(BSA)加入至10mL1640培养基中并混匀，配得BSA浓度为0.5%。PA溶液取0.2mL加入至9.7mL的BSA与1640培养基的混合液中，配得浓度为2mmol/L的PA溶液然后将PA溶液置于55水浴锅中水浴30min细菌滤过器过滤除菌两次.过滤后的PA溶液与完全培养基按照体积比1：9混合稀释10倍配置成0.2mmol/L的PA混合液e剩余的PA溶液按照每次实验预估用量分装，-20°C冰箱储存。1.3HDCA的配置20mg的HDCA溶于100L的二甲基亚砚(DMSO),震荡混匀直至完全溶解，配置成浓度5×10molL的HDCA溶液HDCA溶液取8L,加入992L含10%FBS的DMEM高糖完全培养基,配置成浓度为4000molL的HDCA溶液。HDCA溶液与完全培养基按照体积比1：9稀释10倍配置成浓度AOQmoL的HDCA溶液。100、200、300molL的HDCA溶液从HDCA溶液逐步稀释400molL的HDCA溶液中DMSO的含量为0.08%,低于DMSO对细胞安全界限01%,故本实验不设立DMSO对照组。剩余的HDCA溶液，标记时间和药品名称，密封放入-20冰箱冻存，避免反复冻融。1.4 细胞活性测定